Dies sollte letztlich zum Konflikt mit der katholischen Kirche führen.

Verlief 1611 eine Audienz beim Papst zunächst noch freundlich – Galilei war mittlerweile eine Berühmtheit – zog er sich endgültig den Zorn der Kirche zu, als er 1613 in einer Reihe von veröffentlichten Briefen zu seinen Beobachtungen über die Sonnenflecken, Kopernikus Weltbild explizit zustimmte. 1616 wurde ihm von der Kirche angeraten, die Ansichten des Kopernikus nicht mehr zu lehren (gegen Kopernikus war ein päpstliches Dekret ausgesprochen worden). Trotz seiner Einwilligung veröffentlichte Galilei in den Jahren von 1626-1630 eine Abhandlung über das heliozentrische System, in dem er die Richtigkeit dieses Systems zu beweisen versuchte („Dialog, die zwei Haupt-Weltsysteme betreffend“). Als das Buch 1632 erschien und ein großer Erfolg war, alarmierte dies die Inquisition, die das Buch sofort einziehen und verbieten ließ. Galilei wurde nach Rom zitiert und angeklagt. In dem Prozess im Jahr 1633 wurde Galilei gezwungen, dem heliozentrischen Weltbild öffentlich abzuschwören. Es ist nicht gesichert, ob Galilei wirklich gefoltert wurde und ob der berühmte Ausspruch „und sie bewegt sich doch“ tatsächlich von ihm stammt. Zumindest aber drohte Galilei, der zu diesem Zeitpunkt schon alt und krank war, die Folter und der Scheiterhaufen.

Galilei wurde unter lebenslangen Hausarrest der Inquisition in seinem Landhaus in Arcetri bei Florenz gestellt. Trotzdem forschte Galilei weiter und veröffentlichte trotz Erblindung eine Abhandlung über die Mechanik und die Fallgesetze. 350 Jahre später, im Jahre 1992 wurde Galileo Galilei von Papst Johannes Paul II. halbwegs rehabilitiert. Die Kirche räumte eine ungerechte Behandlung Galileis ein.