1.Vyšetrenie mozgovomiechového moku pri podozrení na bakteriálnu meningitídu.
Odber materiálu
Mozgovomiechový mok sa odoberá prísne asepticky lumbálnou alebo subokcipitálnou punkciou. Odber by mal robiť lekár punkčnou ihlou, ktorá sa zavedie do mozgovomiechového kanála. Likvor sa nechá odkvapkať do sterilnej skúmavky (prázdna, s citrátom sodným, s 10% roztokom glukózy) a ihneď sa má doručiť do laboratória (do 2 hod., ideálne je do 1 hod.) Odoberá sa cca 5 ml.
Spracovanie materiálu
V laboratóriu sa likvor scentrifuguje, supernatant sa opatrne odsaje asi na 1,5 ml. Takýto materiál sa spracováva mikroskopicky. Urobia sa dva nátery, zafarbia sa podľa Gramma a podľa Lofllera. Nátery pred farbením fixujeme metanolom (preliatím do odparenia). Ďalšia časť materiálu sa spracuje serologicky – latexovou aglutináciou na dôkaz najbežnejších patogénov pri bakteriálnych meningitídach.
Latexová aglutinácia
5 protilátok – proti N. meningitidis, Str. pneumoniae, H. influenzae, E. coli, Str. agalactiae. Zmiešame kvapku likvoru s príslušnou latexovou suspenziou. Ak je v likvore prítomný niektorý z patogénov vzniká aglutinácia.
Kultivačné spracovanie
Likvor je u zdravého človeka sterilný, za patologické sa považujú všetky mikroorganizmy prítomné v likvore. Preto je potrebné likvor spracovávať na veľkú škálu kultivačných pôd. KA, MC, ČA, SA, GO (obohatený KA so suplementom). Pomnožovacou pôdou je pečeňový bujón, ktorý sa po 24 hod. vyočkuje na KA a GO.
KA – všetko okrem hemofilov
MC – G- paličky /skvasujúce laktózu, pozit. ružové až červené, negat. vo farbe pôdy/
ČA – hemofily
GO – neisserie
SA – kvasinky a plesne
Diagnostika N. meningitis
Často ako nosičský kmeň, z tampónu z hrdla a nosa. Je pôvodcom epidemického zápalu mozgových blán (meningitída). Podieľajú sa aj na akútnych respiračných ochoreniach (pneumónie, rinofaryngitídy, septikémie).
Mikroskopicky
G- diplokoky /vytvárajú sploštené dvojice/ uložené intracelulárne aj extracelulárne, mikroskopujeme už likvor
Kultivačne
Rastú na obohatenom KA tzv. GO, pri vyššej vlhkosti, vyššom obsahu CO2 (asi 10%), 48 hod. – stredne veľké sivasté kolónie bez hemolýzy.
Biochemické vlastnosti
Majú pozitívnu oxidázovú a katalázovú reakciu.
Oxidázová reakcia – dôkaz produkcie enzýmu cytochrómoxidáza, môže sa urobiť na filtračnom papieriku napustenom činidlom. Filtračný papier sa navlhčí fyziologickým roztokom a bakteriovou kľučkou sa naň natrie baktéria. Pri pozitivite tmavomodrá farba v mieste, alebo nakvapkanie oxidázového činidla priamo na kolónie, v prípade pozitivity kolónie sčernajú.
Katalázová reakcia – rozklad peroxidu vodíka enzýmom kataláza. Do kvapky 3% H2O2 pridáme testovaný kmeň. Pozitivita sa prejaví vznikom bubliniek (rozklad H2O2 na H2O a O2)
Neisseria test
Komerčne pripravená platnička s jamkami a testami /obdoba Enterotestu/. 8 reakcií, 12 kmeňov. Na odlíšenie jednotlivých N., treba čistý kmeň, kultivujeme 24 hod. Zmena farby v jamkách…
Haemophilus influenzae
Neopúzdrené kmene – bežná súčasť flóry dýchacích ciest, môžu sa však uplatniť pri akútnych a chronických bronchitídach.
Opúzdrené kmene – hlavne typ B, vyvolávajú meningitídy, sinusitídy, zápaly priedušnice, spojiviek, stredného ucha, pneumónie (hlavne ako komplikácie vírusových ochorení).
Respiračnou cestou.
Na vyšetrenie sa posielajú výtery z nosohltana, hnis, krv, likvor, punktáty kĺbov, bronchiálny výplach.
Mikroskopicky
Jemné drobné G- paličky , sú veľmi náročné na kultivačné podmienky, pre svoj rast potrebujú v pôde prítomné rastové faktory. Je to rastový
faktor X – hemín a V – nikotínadeníndinukleotid.
Likvor: koncentrácia centrifugovaním, farbenie sedimentu podľa Gramma, vyšetrenie likvoru priamo pomocou latexovej aglutinácie.
Kultivačne
Nerastú na bežnom KA, pre ich záchyt je potrebné použiť ČA. Na ČA rastú ako drobné priesvitné kolónie, veľkosti cca 1mm.
AMEN test – KA naočkujeme po celom povrchu, spravíme čiaru S. aureus. Kultivujeme 24 hod., ak je testovaný kmeň hemofil, je v zóne okolo stafylokoka hemolýza a len tam sú vyrastené kolónie hemofila. SA mu poskytol rastové faktory. /fenomén satelitizmu/. Test závislosti na rastových faktoroch – Na MH agar bez krvi naočkujeme testovaný kmeň, pridáme papierové disky napustené rastovými faktormi /X, XV, V/. Keďže HI potrebuje pre svoj rast aj X aj V faktor, tak ak je testovaný kmeň HI vyrastú kolónie len pri disku XV. H.parainfluenzae potrebuje pre svoj rast faktor V.
2.HEMOKULTIVÁCIE – spracujte a vyšetrite krv na hemokultiváciu pri septických stavoch.
Krv je u zdravého človeka sterilná. Pri podozrení na sepsu odoberáme krv na hemokultiváciu. Krv sa odoberá z lakťovej jamky po dôkladnej dezinfekcii miesta vpichu. U dospelých 10 ml, u detí 3-5 ml, u novorodencov aspoň 1 ml. Krv sa odoberá do striekačky bez protizrážavých látok a ihneď po odbere sa prenesie do hemokultivačnej nádoby. Hemokultivačné nádoby obsahujú tekutú kultivačnú pôdu, má zloženie, ktoré umožňuje záchyt prakticky všetkých druhov mikroorganizmov, ďalej obsahuje ionexy, slúžia na vychytávanie zvyškov ATB v krvi pacienta. Hemokultúry by sa mali odoberať pred začatím ATB liečby, treba ich odoberať opakovane, aspoň 3x v období vzostupu TT. BACTEC – obsahuje tekutú pôdu, kovový vrchnák, gumenná zátka. Naočkovaná nádobka sa vloží do termostatu, ktorý je spojený s meracím systémom a počítačom, každé 3 min sa meria obsah CO2 v jednotlivých nádobkách (cez dno). Ak sa baktérie množia produkujú CO2, počítač
nádobku označí ako pozitívnu. Takáto nádobka sa vyberie z termostatu a spracuje.
Mikroskopicky
Nádobku pretrepať, inj. ihlou nabrať krv, spraviť náter, preparát, nechať zaschnúť, fixovať metanolom a ofarbiť podľa Gramma.
Kultivačne
Krv vyočkujeme na KA, MC, SA, a súčasne podľa mikroskopického nálezu. Urobíme diskový test citlivosti na ATB.
Diagnostika
Acinetobacter species – nozokomiálne infekcie, polyrezistentné kmene.
Mikroskopia – G- kokobacily, v preparátoch z umelých pôd koky. V preparátoch majú typické usporiadanie (mozaikovité útvary).
Kultivačne – rastú na KA, ako stredne veľké, belavé, vypuklé, pologuľovité kolónie. Na MC ako drobné laktóza negat. kolónie.
Biochemicky – patria medzi nefermentujúce baktérie, majú iba oxidačný metabolizmus. Majú negat. oxidázovú reakciu. Na presné určenie druhu používame identifikáciu pomocou NEFERMTEST.
Pseudomonas aeruginosa – Pre zdravých ľudí neznamená hrozbu, potencionálny patogén, postihuje hlavne oslabených jedincov, často pôvodca nozokomiálnych infekcií. Vyvoláva hlavne inf. močových ciest, z. stredného ucha, z. mozgových blán, črevné inf. (hlavne u novorodencov a dojčiat), sepsy, hnisavé zápalové procesy rán, aj ako agens, aj ako sekundárna kontaminácia rany. 10% nozokomiálnych nákaz spôsobuje Ps. aeruginosa. Mikrób je pomerne odolný voči vonkajším vplyvom, dezinfekčným prostriedkom. Veľmi dobre sa mu darí vo vlhkom prostredí (umývadlá, výlevky), v roztokoch (ušné, očné kvapky). Kontaminuje rôzne povrchy, nádoby, gumové katétre, plastové predmety, personál. Závažná je jeho R na ATB, je primárne rezistentný na väčšinu bežných ATB /PNC, AMP, cefalosporíny/.
Mikroskopicky – drobné G- pohyblivé, nesporulujúce štíhle paličky
Kultivačne – má typické rastové vlastnosti. Na KA rastie vo veľkých, sivých kolóniách s drsným povrchom, kovovým leskom a zónou hemolýzy. 24 hodinové kultúry majú typickú vôňu /jazmín/. Na pôdach bez krvi rastie v pigmentovaných kolóniách (pyocyanín-mz, fluoresceín-žz, pyoverdín-hč).
Biochemicky – má pozit. oxidázovú aj katalázovú reakciu, patrí medzi nefermentujúce baktérie, má oxidačný metabolizmus. Hajn, MIU. Určenie rodu a druhu je možné pomocou NEFERMTESTU.
Serologická typizácia – pomocou sér (podľa O antigénu 17 typov), je dôležitá z epidemiologických dôvodov.
Citlivosť na ATB – STR, TET, GEN, AZL /azlocilín/, TIC /tikarcilín/, OFL /ofloxacín/
3.Spracujte a vyšetrite moč kvantitatívne a kultivačne.
Odber materiálu
Na kultivačné vyšetrenie sa moč musí odoberať tak, aby sa vylúčila kontaminácia odobratého moču. Odoberá sa stredný prúd moču do sterilnej skúmavky, alebo cievkovaný moč len u novozavedenej cievky. U malých detí robíme odber pomocou plastikového sáčku, ktorý sa otvorom nalepí na ústie močovej rúry. Odber suprapubickou punkciou, je napichnutie močového mechúra punkčnou ihlou cez brušnú stenu (najmä u malých detí). Moč sa má spracovať do 2 hod. po odbere.
Spracovanie materiálu
Moč sa vyšetruje kvantitatívne, stanoví sa počet baktérií v ml moču. Moč riedime v pomere 1:100 a to tak, že 50 ul + 5 ml fyziologického roztoku. Z takto riedeného moču očkujeme 50 l na CLED agar a 50 ul na MC. Necháme asi 15 min vsiaknuť a rozočkujeme po povrchu platne… medzi jednotlivými túrami kľučku nevypaľujeme.
CLED agar – univerzálna pôda - G- paličky, G+ koky. Potláča plazivý rast Protea mirabilis (KA to nespraví). McConkey agar – G- paličky, Kultivujeme 24 hod. a hodnotíme kvantitu:
1.0 – pôdy ostali sterilné
2.1-4 kolónie - viac ako 104 baktérií / 1 ml moču – bezvýznamná bakteriúria
3.5-50 kolónií – 104 – 105 baktérií / 1 ml moču – suspektná (pravdepodobná) bakteriúria
4.nad 50 kolónií - viac ako 105 baktérií / 1 ml moču – významná bakteriúria
5.2 a viac bakteriálnych druhov – kontaminovaný moč
Kvalitatívne a kvantitatívne vyhodnotenie citlivosti na ATB – princíp diskovej metódy /vysvetliť, vyhodnotiť, naočkovať kmeň a pridať disky/.
4.Spracujte a vyšetrite hnis na prítomnosť aeróbnych a anaeróbnych baktérií pri hnisavých ochoreniach.
Odber materiálu
Najčastejšie sa odoberá ster z chorobných plôch pomocou vatového tampónu. Odoberá sa vždy z rozhrania medzi zdravým a poškodeným tkanivom. Tekutý materiál sa odoberá pomocou punkčnej ihly do sterilnej skúmavky. Pri odbere na anaeróbne vyšetrenie sa tekutý materiál odoberie do injekčnej striekačky, z ktorej vytlačíme prebytočný vzduch a ihlu zapichneme do gumovej zátky. Kúsky tkaniva je možné posielať v skúmavkách naplnených CO2. Možné sú aj transportné pôdy.
Spracovanie na pôdy – anaeróbne
Materiál sa očkuje na KA, MC, SA. Pomnožovacia pôda je pečeňový bujón, ktorý po 24 hod. vyočkujeme na KA. Pri steroch z hlavy pridávame aj ČA (hemofily).
Spracovanie materiálu na aeróbnu kultiváciu
Anaeróbne baktérie sú charakteristické tým, že vo svojom životnom prostredí neznášajú kyslík. Podľa schopnosti rastu v prítomnosti O2, rozlišujeme základné skupiny: - aerotolerantné (5% O2) – Clostridium perfringens
-stredne prísne anaeróby (1-2% O2), patrí sem väčšina lekársky dôležitých druhov – Cl. sporogenes, Bacteroides fragilis
-prísne anaeróby (menej ako 1% O2) – Cl. haemolyticum
Očkuje sa na VL agar (Veillonov) a na VL agar s ATB /vysoko naliate pôdy, obsahujú redukujúce látky, znižujúce oxidačno-redukčný potenciál pôdy, je to hodnota elektrického napätia prostredia/. Anaeróby rastú pri záporných hodnotách redox potenciálu, keď v prostredí prevládajú redukované látky. Anaeróby sa nevedia chrániť pred účinkami napr. pred toxicitou peroxidu vodíka. Peroxid vodíka vzniká pri reakcii kyslíka s vodíkovými iónmi. Anaeróbne baktérie nemajú enzým peroxidáza (alebo len málo účinný). Pomnožovacou pôdou je VL bujón, ktorý sa po 48 hod. vyočkuje na VL agar. VL bujón sa pred použitím musí regenerovať varom,
vo vodnom kúpeli, aby sa odstránil prebytočný O2. U materiálov s podozrením na klostrídiovú infekciu očkujeme aj VL agar s parafínom. Naočkovaný materiál zalejeme parafínom /10 min, 80°C/, bežné baktérie zahynú, klostrídie vytvárajú spóry. Kultivujeme 24 hod., ak tam boli klostrídie je parafín vytlačený nahor. Urobíme preparát – veľké, hrubé G+ paličky.
Anaeróbne materiály musíme kultivovať v anaeróbnom prostredí – ANAEROSTAT. Nádoba obsahuje držiak na skúmavky, vyvýjač CO2 a H, katalyzátor, indikátor prostredia. Celá nádoba sa vloží do termostatu a kultivuje sa 48 hod.
a.priamy mikroskopický preparát zafarbený podľa Gramma, orientačné farbenie najmä na klostrídie /hrubé G+ paličky/
b.tuhé pôdy – VL agar s krvou, VL agar s ATB (VAN, KAN, STR) na potlačenie rastu nežiadúcich baktérií
c. tekuté pôdy – VL bujón, kultivovať v anaeróbnom prostredí, alebo zaliaty vrstvou sterilného parafínu, pred použitím prevariť (regenerovať, odstrániť vzduch z pôdy)
d.hemokultivačné nádoby – sú špeciálne na kultiváciu anaeróbov, odber krvi priamo do nádobiek
1. odstránenie kyslíka z prostredia chemickou cestou, reakcia pyrogalolu so sódou. Potreby: čistý pyrogalol, hydrouhličitan sodný, filtračný papier, lepiaca páska, Petriho misky s VL agarom. Postup: na filtračnom papieri zmiešať 4:1, zložiť papier, prilepiť, navlhčiť, misku zalepiť leukoplastom alebo zaliať voskom.
2. Anaerostat OXOID – Katalyzátor (kovová sieťka s peletami s vrstvičkou paládia, treba po použití znova regenerovať). Zmes, ktorá po pridaní vody uvoľňuje H2 a CO2, pomocou katalyzátora sa prítomný kyslík zlučuje s vodíkom na H2O pri pomerne nízkej teplote /cca 150°C/. Indikátor anaeróbneho prostredia.
3.Biologický spôsob odstránenia kyslíka z prostredia pomocou kmeňa Serratia marcescens.
4.Fyziologický spôsob – odsatie vzduchu a jeho nahradenie dusíkom, CO2, alebo ich zmesou.
Laboratórna diagnostika rodu stafylokokov
Stafylokoky – jedny z najčastejších pôvodcov pyogénnych /hnisavých / ochorení. Vyvolávajú hnisavé zápaly oka, ucha, kože, rán, prsnej žľazy, okostice, septické stavy, meningitídy atď. Dve veľké skupiny: Stafylococcus aureus a iné stafylokoky.
Mikroskopicky
G+ koky, v preparáte usporiadané v strapcoch (skupinkách)
Kultivačne
Dobre rastú na KA. SA rastie v okrúhlych, stredne veľkých kolóniách s výraznou zónou hemolýzy. Kolónie sú pigmentované od žltej po oranžovú. Koaguláza negat. stafylokoky rastú na KA ako menšie porcelánovo biele ploché kolónie bez zóny hemolýzy.
Biochemické vlastnosti
SA sa od ostatných stafylokokov líši testami na dôkaz plazmakoagulázy. SA má pozitívnu voľnú aj viazanú plazmakoagulázu.
Test viazanej plazmakoagulázy – na sklíčku do kvapky králičej plazmy pridáme kľučkou testovaný kmeň. Pozit. reakcia sa prejaví vyčírením plazmy a vznikom zhlukov. Pri negat. reakcii ostane kvapka mliečne zakalená.
Dôkaz voľnej plazmakoagulázy – do skúmavky, v ktorej je cca 1 ml králičej plazmy, kľučkou pridáme testovaný kmeň a inkubujeme v termostate. Reakciu hodnotíme po 6-12 hod. Pozit. reakcia sa prejaví stuhnutím obsahu skúmavky. Negat. reakcia je ak plazma ostane tekutá.
Test produkcie DN-ázy – rozklad DNA, robíme ho na pôde, ktorá obsahuje DBA. Na pôdu naočkujeme testované kmene, inkubujeme 24 hod. a potom povrch pôdy prelejeme zriedenou HCl. Ak kmeň štiepi DNA celá pôda sa mliečne zakalí a zóna okolo kmeňa je číra (vyprodukoval DN-ázu). Ak kmeň DN-ázu neprodukuje, pôda ostane bez zóny, mliečne zakalená, matná bude celá pôda. Jednotlivé druhy stafylokokov identifikujeme pomocou STAPHYTESTU.
Farbenie na spóry
Diagnostika klostrídiových infekcií
Najčastejšie zachyteným kmeňom je Cl. perfringens. Rastie na VL-agare za anaeróbnych podmienok, ako veľké nepravidelné kolónie s dvojitou zónou hemolýzy.
Mikroskopicky
Veľké G+ paličky s tupými koncami. Cl. tvorí spóry, ktoré prežívajú vo vonkajšom prostredí. Ak sa dostanú na vhodné miesto, napr. do rany bez prístupu O2, spóra vyklíči a začnú rásť tzv. vegetatívne
b. Na dôkaz tvorby spór používame farbenie podľa Scheffera a Fultona: testovanú kultúru pridáme do kvapky fyziologického roztoku na podložnom sklíčku. Suspenziu necháme vyschnúť a fixujeme teplom. Farbíme za tepla 5% malachitovou zeleňou asi 5 min. Farbivo opláchneme vodou a dofarbíme 1 min. eozínom. Výsledok farbenia: spóry budú zelené /malachitová zeleň/ a telo bude ružové /eozín/.
5. Spracujte a vyšetrite výter z hrdla pri diagnóze reumatická horúčka.
Vykonajte laboratórnu diagnostiku hemolytického streptokoka najmä skupiny A a B.
Odber materiálu
Pri výteroch z HCD odoberáme tampón z tonzíl tak, aby sme otreli povrch oboch mandlí. Podľa možnosti sa nedotýkame jazyka. Pri abscesoch v mandliach je potrebné mandľu stlačiť a odobrať hnis vytekajúci z dutín. Výtery z nosa je vhodné robiť po navlhčení tampóna sterilným fyziologickým roztokom.
Kultivačné vyšetrenie
Odobraté výtery očkujeme na 3 pôdy /polovice pôd/ - KA, ČA, SA. Očkujeme z každej vzorky na pol platne.
KA – streptokoky, stafylokoky, bežná flóra HCD
ČA – hemofily
SA – kvasinky
Diagnostika hemolytických streptokokov
Streptokoky – G+ koky v mikroskopickom obraze usporiadené vo dvojiciach, resp. v retiazkach. Sú podobne ako stafylokoky jedny z najčastejších pôvodcov hnisavých /pyogénnych/ infekcií. Vyvolávajú angíny, respiračné infekcie, infekcie rán a kože, infekcie močových ciest, septické stavy, meningitídy, nešpecifické infekcie urogenitálneho traktu.
Mikroskopická
G+ koky usporiadané v retiazkach. Veľmi typické je usporiadanie pneumokokov, sú to G+ diplokoky lancetovitého tvaru.
Kultivačná
Rastú na KA a spôsobujú tri typy hemolýzy.
1.-hemolytické – viridujúce – krv je rozložená len čiastočne a kolónie streptokokov sú obklopené zelenkastou zónou.
2.-hemolytické – úplná hemolýza – kolónie na KA majú okolo priesvitnú rôzne širokú zónu.
3.-hemolytické – anhemolytické – kolónie streptokokov rastú bez zóny hemolýzy
Ďalšie vlastnosti
Na odlíšenie -hemolytických streptokokov podľa jednotlivých antigénnych skupín používame viacero testov. Latexová aglutinácia – pomocou protilátok na latexových časticiach. Súprava obsahuje 6 latexových suspenzií skupiny A, B, C, D, F, G. Aglutinácia sa robí na kartičke s vyznačenými zónami. Z kolónií streptokokov pripravíme suspenziu v extrakčnom roztoku. Necháme 10 min. v termostate. Zmiešame 1 kvapku extraktu s jednou kvapkou latexových suspenzií. Zmiešame a pozit. aglutinácia sa prejaví vyčírením suspenzie.
Bacitracínový test - na dôkaz streptokokov skupiny A – Princíp: Streptokoky skupiny A /Str. pyogenes – reumatická horúčka, z. obličiek, šarlachový kmeň/ sú in vitro citlivejšie na bacitracín ako kmene iných streptokokov. Postup: Na KA sa naočkuje testovaný kmeň streptokoka. Do stredu naočkovanej pôdy sa priloží disk z filtračného papiera, ktorý obsahuje 0,7j. bacitracínu. Inkubujeme do druhého dňa, kedy odčítame zábranu hemolýzy a rastu. Ak je zábrana 16 mm a viac ide o streptokoka skupiny A. Streptokoky skupiny A sú 100% citlivé na PNC.
CAMP test - Test na dôkaz streptokokov skupiny B – Str. agalactiae. Princíp: Streptokoky skupina B produkujú substanciu, ktorá hemolyzuje baranie krvinky, na ktoré predtým pôsobil stafylokokový beta-toxín. Postup: Na KA sa naočkuje vo forme čiar kmeň streptokoka a kolmo na tieto čiary sa naočkuje kmeň stafylokoka produkujúceho beta-toxín. Inkubujeme do druhého dňa. Pozitívna reakcia – v mieste kríženia očkovacích čiar vznikne klinovitá zóna úplnej hemolýzy.
Testovanie citlivosti na ATB
Používame MH agar s krvou. Pripravíme suspenziu kmeňa vo fyziologickom roztoku, zákal 0,5 McFarlandovej stupnice. Sterilným tampónom naočkujeme celú platňu, pridáme ATB disky (6) : PNC - penicilín, TET – tetracyklín, CHP – chloramfenikol, LIN – linkomycín, ERY – erytromycín, COT – cotrimoxazol /biseptol/.
6. Spracujte a vyšetrite výter z konečníka pri hnačkových ochoreniach.
Zamerajte sa na salmonelózu a šigelózu. Spracovanie tampónu z konečníka kultivačne, popis morfologických, rastových a biochemických vlastností patogénnych enterobaktérií. Laboratórna diagnostika pomocou pôd Hajn a MIU.
Odber materiálu
Tampón rekta musí byť po odbere sfarbený od stolice. Mala by ho odoberať sestra, nie sám pacient. Vhodné je odoberať aj stolicu, baktérie lepšie prežívajú transport.
Kultivačné spracovanie
Kultivačne náročné, očkujeme KA, MC, DEZO. Tampón sa vloží do pomnožovacej pôdy – Selenitova pôda, potláča rast bežných črevných baktérií a podporuje rast črevných patogénov /Salmonela, Šigela, Yersínia/. Selenitova pôda sa po 24 hod. preočkuje na dve pôdy, na DEZO a na XLD agar (Wilson-Blair pôda). Súčasťou kultivácie je aj kultivácia na Campylobacter jejuni, pomocou špeciálnej pôdy, ktorá obsahuje ATB a niektoré rastové zložky. Kultivujeme ju 48 hod., očkujeme celú plochu, pri 42°C, zvýšenom CO2 a zvýšenej vlhkosti.
Identifikácia podozrivých kolónií
SALMONELLA
Podľa priebehu ochorenia vyvolávajú dva rozličné typy ochorenia.
1. brušný týfus, paratýfus a ochorenie vyvolané Salm. cholerae suis. Brušný týfus je celkové ochorenie /Salm. typhi/, septický stav.
2.salmonelovú gastroenteritídu, v klinickom obraze dominuje hnačka, stolica je vyslovene vodnatá. Rastie na MC ako laktóza negatívne kolónie (svetlo žltkasté kolónie), na DX rastie ako laktóza negatívne kolónie s čiernym stredom. DX obsahuje aj soli Fe a salmonela produkuje sírovodík, t.z. pri raste vzniká čierny sulfid železnatý. Podozrivé kolónie ďalej identifikujeme pomocou biochemických testov.
Diagnostika týfus
- Hemokultúra: Priamy dôkaz pôvodcu ochorenia, už v prvom týždni ochorenia. Vyočkujeme na obohatený KA.
- Výter z rekta, moč, pozitivita v 2.-3. týždni ochorenia.
Očkujeme: KA, MC, DC, WB, selenit WB, DC.
Identifikácia: Hajn, MIU, Enterotest
Typizácia: polyvalentné a monovalentné séra
Serologická diagnostika: Widalova reakcia, O Ag, H Ag, Vi Ag.
Diagnostika salmonelovej gastroenteritídy
- Rektálny výter očkujeme na KA, MC /ENDO/, DC, selenitova pôda WB, DC
- na diagnostických pôdach rastú salmonely ako laktóza negatívne kolónie, na DC s čiernym stredom, na WB pôde v čiernych kovovo lesklých kolóniách s redukčným stredom
Identifikácia: Hajn, MIU, Enterotest
Typizácia: polyvalentné a monovalentné séra /spätná aglutinácia/
SHIGELLA
Šigely sú pôvodcami črevnej choroby zvanej šigelóza – bacilárna úplavica, dyzentéria. Krátka inkubačná doba (3-5 dní), Príznaky slabosť, nechutenstvo, kolikovité bolesti brucha, s nútením na stolicu (tenezmy), hnačka (až 30 denne), stolica je hlienovitá, malá prímes krvi. Ochorenie špinavých rúk, fekálno – orálnou cestou, výnimočne potravou. U nás prevažujú ochorenia vyvolané Sh. sonnei, Sh. flexneri typu 3a, 2a.
Diagnostika:
-na vyšetrenie odoberáme rektálny výter. Čo najrýchlejšie spracujeme, šigely sú veľmi citlivé na vplyvy vonkajšieho prostredia.
-spracovanie: KA, ENDO (MC), DC, selenitova pôda (nie je však vhodná na pomnoženie šigel)
-identifikácia: Hajn, MIU, Enterotest
- šigely sú nepohyblivé, G negatívne , laktóza negatívne, manitol negatívne /Sh. dysenteriae/, manitol pozitívne /Sh. flexneri, boydii, sonnei/
-typizácia kmeňa: určenie antigénnej štruktúry pomocou známej protilátky /spätná aglutinácia/
-serologická diagnostika nemá praktický význam
Určovanie biochemických vlastností enterobaktérií
Hajn a MIU sa očkujú tou istou kľučkou bez vypálenia.
Hajn – šikmo naliata, tuhá červená pôda. Obsahuje tri cukry – glukóza, sacharóza, laktóza. Zožltnutie pôdy znamená pozit. skvasovanie.. Pôda obsahuje soli Fe, baktérie tvoriace sírovodík spôsobia sčernanie dolnej časti pôdy. Baktérie, ktoré tvoria plyn, spôsobia trhliny, bubliny v pôde. Pôdu očkujeme kľučkou, naočkujeme vždy iba jednu izolovanú kolóniu.
MIU – polotuhá pôda v skúmavke. Tri vlastnosti: ureáza, motylita, indol. Očkuje sa vpichom do 2/3 pôdy. Tvorba enzýmu ureáza. Pôda obsahuje ureu a farebný indikátor. Ak baktérie tvoria ureázu štiepia ureu na amoniak a vodu, vzniká zásadité pH a pôda zmení farbu na červenú. Motylita, pohyb, ak baktérie rastú len v mieste vpichu sú nepohyblivé, ak je prítomný zákal, baktérie sú pohyblivé. Indol – po 24 hod. kultivácii a pridaní Kováčovho činidla /3-4 mm/, pri pozit. produkcii indolu činidlo zmení farbu na červeno. Negat. ak činidlo zostane nezmenené.
glukóza sacharóza laktóza H2S plyn ureá zapo hybindol
Salmonella +--+--+-
Shigella +------- x
E. coli +++-+-++
x – Sh. flexneri – indol pozitívna
Enterotest 16
Mikrometóda, určujeme ňou biochemické vlastnosti v jamkách mikroplatničky. Jamky sú naplnené lyofilizovanými substrátmi pre jednotlivé vlastnosti. Jeden kmeň očkujeme súčasne do dvoch riadkov. V 2,5 ml sterilného fyziologického roztoku si pripravíme suspenziu 0,5 McF. Do jednotlivých jamiek testu dáme po 0,1 ml suspenzie a súčasne očkujeme aj kontrolu čistoty kmeňa – na MC. Niektoré testy prebiehajú bez prístupu vzduchu, takže povrch jamiek prevrstvíme sterilným
parafínovým olejom. Naočkované platne vložíme do igelitového vrecka a inkubujeme 37°C/ 20 hod. Hodnotíme farebné zmeny v jamkách. Vlastnosti určované enterotestom: skvasovanie 7 cukrov, tvorba sírovodíka, tvorba indolu, tvorba ureázy, spotrebovanie citrátu, produkcia dekarboxyláz – lyzín, ornitín.
Serologické určovanie antigénnej štruktúry – sérotypizácia črevných patogénov Po určení biochemických vlastností je potrebné určiť aj antigénnu štruktúru črevných patogénov a to najmä Salmonelly. Salmonely majú veľké množstvo rôznych bičíkových a telových Ag. Podľa toho, ktorý Ag daný kmeň má ho zaraďujeme k jednotlivým tzv. sérotypom. Používame sadu králičích antisér, ktoré sú vysýtené tak, aby obsahovali len jeden daný typ protilátky.
7. Spracujte výter z konečníka na pevné a tekuté pôdy pri diagnóze
gastroenteritis. Popis základných morfologických, kultivačných a biochemických vlastností enteropatogénnych E. coli, Campylobacter a Helicobacter. Vykonajte spätnú aglutináciu E. coli a bližšiu identifikáciu rodov Campylobacter a Helicobacter.
Odber materiálu
Tampón rekta musí byť po odbere sfarbený od stolice. Mala by ho odoberať sestra, nie sám pacient. Vhodné je odoberať aj stolicu, baktérie lepšie prežívajú transport.
Kultivačné spracovanie
Kultivačne náročné, očkujeme KA, MC, DEZO. Tampón sa vloží do pomnožovacej pôdy – Selenitova pôda, potláča rast bežných črevných baktérií a podporuje rast črevných patogénov /Salmonela, Šigela, Yersínia/. Selenitova pôda sa po 24 hod. preočkuje na dve pôdy, na DEZO a na XLD agar (Wilson-Blair pôda). Súčasťou kultivácie je aj kultivácia na Campylobacter jejuni, pomocou špeciálnej pôdy, ktorá obsahuje ATB a niektoré rastové zložky. Kultivujeme ju 48 hod., očkujeme celú plochu, pri 42°C, zvyšeného CO2 a zvýšenej vlhkosti.
E. coli
Väčšina kmeňov je nepatogénnych, fyziologicky sa nachádza v dolných úsekoch tráviaceho traktu, kde tvorí významnú súčasť fyziologickej flóry, tvorí vitamín K, čiastočne vitamín B.
Niektoré kmene E. coli vyvolávajú hnačkové ochorenia, väčšina môže vyvolávať mimočrevné ochorenia hnisavého charakteru. Spôsob prenosu všetkých črevných ochorení vyvolaných E.coli je fekálno – orálny.
1. EPEC – enteropatogénne E.coli - vyvolávajú hlavne dojčenské enteritídy (sérovary O26, O55, O111, O119, O125, O126 atď.). Príznaky: vracanie, hnačka, hlienovitá až vodnatá stolica, dehydratácia.
2. EIEC – enteroinvazívne E.coli – prenikajú do epitelu sliznice hrubého čreva, pôsobia podobne ako šigely. Sérovary O124, O143, O144.
3. ETEC – enterotoxické E.coli – kmene produkujú exotoxíny, termolabilný a termostabilný. Vyvolávajú hnačkové ochorenia, ktorých
závažnosť kolíše od miernych až po život ohrozujúce.
4. EHEC – enterohemoragické E.coli – viažu sa na bunky hrubého čreva, produkujú toxíny, verotoxíny. Vyvolávajú hemoragickú kolitídu až hemoragický uremický syndróm.
Diagnostika
- odoberáme stolicu, resp. tampón z rekta
- očkujeme: KA, ENDO, DC, pomnožovaciu pôdu – selenitovú, ktorú na druhý deň vyočkujeme na DC, Wilsonovu-Blairovu pôdu. (používame pôdy,
ktoré umožňujú záchyt väčšiny pôvodcov hnačkových ochorení)
- kmene E. coli vyrastajú na diagnostických pôdach ako laktóza pozitívne kolónie, na KA veľké sivasté kolónie, s hemolýzou, alebo bez
hemolýzy.
- kmene E. coli izolované od detí do 1 roka – aglutinujeme spätnou aglutináciou, či sa nejedná o EPEC.
Pripravíme si suspenziu vo fyziologickom roztoku (mliečna), dve kvapky suspenzie, pridáme králičie antiséra, polyvalentné A a B, zamiešame a pozorujeme aglutináciu, vyčírenie a drobné biele zhluky.
polyvalentné A – O26, O55, O111, O124
polyvalentné B – O86, O119, O125, O126, O128
CAMPYLOBACTER
Používa sa pôda pre Campylobacter. Kultivuje sa 48 hod./42°C, CO2 a vlhkosť. Campylobacter rastú ako sivohnedé kolónie, zlievajú sa pozdĺž očkovacích čiar /tamp./
-mikroskopický preparát farbený podľa Gramma. Campylobacter sú jemné zahnuté paličky
-biochemické vlastnosti – oxidáza pozitívna /na papieriku/ a kataláza pozitívna
-JEJUNI / E. coli – líšia sa hydrolýzou hyppurátu
- test citlivosti na ATB – robí sa na pôde pre Campylobacter, sú citlivé na erytromycín, ampicilín, amoxycilín + kys. klavulánová /augmentin/, cotrimoxazol /biseptol/ sulfonamid + trimetoprim
H. PYLORI
Laboratórna diagnostika sa robí z bioptického materiálu odobratého sondou zo žalúdočnej sliznice. Transport v 20% roztoku glukózy. Biopsia sa na sterilnom podložnom sklíčku pomocou dvoch ihiel rozdelí na maličké kúsky.
Ureázový test – test rýchlej ureázy, robí sa v skúmavke naplnenej roztokom urey s farebným indikátorom. Pri pozitivite sa pôvodne svetlý roztok mení na červený.
Mikroskopický preparát – kúsky biopsie sa nechajú dobre vyschnúť, fixujeme metanolom a farbíme bázickým fuksínom 3 min, mikroskopujeme pri 1000x zväčšení celú plochu preparátu. /sýto ružovo sfarbené/
Kultivácia – obohatený KA s ATB, je potrebná vlhkosť, CO2, 37°C. Kultivácia trvá 5 dní. HP rastie ako drobné, priesvitné kolónie. Z kultúry robíme mikroskopický preparát /bázický fuksín/. HP má pozitívnu oxidázovú a katalázovú reakciu.
8. Spracujte a vyšetrite výter z tonzíl a nosa pri zápaloch HCD.
Spracujte a vyšetrite spútum pri zápaloch DCD. Vykonajte laboratórnu diagnostiku Streptococcus pneumoniae.
Odber materiálu
Spútum odoberáme do nádobiek so širším hrdlom. Odoberať treba spútum, nie sliny.
Spracovanie materiálu
Spútum: riedime ho v pomere 1:1 2% roztokom broncholyzínu, necháme trepať na trepačke, aby sa rozpustili vločky hlienu. Z homogenizovaného spúta pripravíme 2 nátery. Jeden zafarbíme podľa Gramma, druhý podľa Ziehl-Nielsona na acidorezistentné paličky. Farbenie podľa Ziehl-Nielsona –
1.fixácia metanolom
2. koncentrovaný karbolfuksín 5 min za tepla /praparát zohrievame až do výstupu pár/ karbolfuksín dolievame, preparát nesmie vyschnúť
3.farbivo zlejeme a preparát oplachujeme kyslým alkoholom, dovtedy, kým odteká farba
4.opláchneme vodou a dofarbujeme metylénovou modrou, alebo malachitovou zelenou
Výsledok: Acidorezistentné paličky sú zafarbené na ružovo, ostatné baktérie sú modré.
Spútum ďalej spracovávame riediacou metódou. Riedime ho v mikroplatničke v 7 jamkách. Očkujeme na štyri pôdy.
1234567
riedenie
roztoku-175ul175ul175ul175ul175ul175ul
spútum200ul
prenášame 25ul
posledné vylejeme
136
KA
ČA
MC
SA
Očkujeme z 1, 3, 6, jamky po 25 ul kľučkou celú plochu. Ak rastú baktérie vo vyočkovaní zo 6 jamky, spútum hodnotíme ako pozitívne. Ak je v riedení z 3 jamky viac ako 5 kolónií, spútum hodnotíme ako pozitívne. Ak rastú baktérie len vo vyočkovaní z prvej jamky, spútum je negatívne.
Streptococcus pneumoniae
Rastie na KA ako viridujúci streptokok, tvorí dvojaké kolónie, preliačnený stred pri pohľade zboku. Opúzdrené kmene rastú ako veľké, mukózne, roztekajúce sa kolónie.
Mikroskopicky
Podľa Gramma sú to G+ koky, usporiadané vo dvojiciach typického tvaru. Na dôkaz púzdra používame farbenie podľa Burriho. Na podložnom sklíčku v kvapke čierneho tušu rozmiešame bakteriálnu kultúru, hranou druhého sklíčka spravíme tenký náter, necháme ho vyschnúť. Farbíme karbolfuksínom v kyvete asi 1 min a oplachujeme vodou, tiež v kyvete, usušíme a mikroskopujeme pri 1000x zväčšení. Telá baktérií sú zafarbené na ružovo, púzdro zostane nezafarbené, priesvitné. Zóna okolo baktérií a pozadie je čierne. /tzv. negatívne farbenie/ Pri diagnostike pneumokokov využívame aj citlivosť na optochín.
Optochínový test – test robíme na KA, na celú plochu pôdy naočkujeme kmeň a pridáme optochínový disk. Po 18 hod. kultivácie hodnotíme veľkosť zábrany rastu. Pozitívny dôkaz pneumokoka sa prejaví zónou zábrany rastu aspoň 16 mm.
9. Spracujte a vyšetrite výtery z pohlavných ciest pri podozrení na kvapavku. Popíšte odber a transport materiálu. Spracujte materiál kultivačne, popíšte morfologické, rastové a biochemické vlastnosti Neisseria gonnorhoeae.
Odber mateiálu
Materiál na kvapavku sa odoberá u žien najčastejšie z hrdla maternice, u mužov z močovej trubice. Tampón sa musí transportovať v polotuhej Stuartovej pôde.
Spracovanie materiálu
Tampóny sa očkujú na obohatený KA a na obohatený KA s ATB. Kultivácia 48 hod./ 37°C, vlhkosť, CO2.
Neisseria gonorrhoeae Sú drobné G- negatívne diplokoky, v mikroskopickom obraze pripomínajú kávové zrná. Sú často uložené v leukocytoch, fagocytované. Nesporulujú, nie sú pohyblivé, netvoria púzdra. Sú náročné na kultiváciu (KA s prísadou séra, alebo ascitu), vyžadujú pri kultivácii dostatok vlhkosti, zvýšený obsah CO2, kultivujú sa spravidla 48 hod. Je pôvodcom ľudského ochorenia – kvapavky (gonorea)
Diagnostika
1. mikroskopický preparát – G- diplokoky (môžeme ich diagnostikovať priamo z hnisu, alebo sekrétu), uložené sú spravidla intracelulárne.
2. kultivačná – kultivujeme ich na obohatenom KA, tzv. GO pôda a na KA obohatenom + ATB na potlačenie sprievodnej flóry, vyššom obsahu CO2
(asi 10%) a 48 hod. Kolónie na tuhých pôdach rastú ako drobné priesvitné, okrúhle kolónie, prirovnávajú sa ku kvapke rosy.
3.pozitívna oxidázová a katalázová reakcia
4.biochemické vlastnosti určujeme pomocou Neisseriatestu, 8 vlastností
5. Phadebact Monoclonal GC test - Latexová aglutinácia, serologická typizácia kmeňov N.gonorrhoeae. Vykonanie: do 0,5 ml fyz. roztoku suspendujeme kolónie testovaného kmeňa, 5 min. povaríme. Kvapku suspenzie zmiešame s kvapku séra - dva antigény: W I, W II / III. V prípade pozitivity dochádza k aglutinácii.
10. Laboratórne metódy, ktoré informujú o stave imunitného systému.
Postup pri odbere krvi a príprave séra na serologické reakcie.
Aglutinačné reakcie – Widalova reakcia.
Odber materiálu
Odoberá sa venózna krv, najčastejšie z lakťovej jamky bez antikoagulancií. Krv necháme postáť, oddelíme krvný koláč a scentrifugujeme. Sérum odsajeme do ďalšej sterilnej skúmavky. Sérum nesmie byť chylózne, hemolytické alebo kontaminované. V sére dokazujeme najčastejšie protilátky, v niektorých stanoveniach aj antigény.
Antigény môžu byť korpuskulárne, patria sem baktérie, vírusy, kvasinky a nosiče antigénu. Ako nosič antigénov sa používajú latex, erytrocyty alebo bentonit. Nekorpuskulárne antigény sú enzýmy alebo toxíny baktérií. Prostredia sú fyziologický roztok, tlmivé roztoky rôzneho zloženia, príp. tlmivé roztoky s bielkovinou (albumín)
Widalova reakcia
Používa sa na dôkaz P proti sal. typhi, pri ochorení na brušný týfus. P sa objavujú v sére chorého na 5-6 deň od začiatku ochorenia. Odoberáme aj párovú vzorku v odstupe aspoň 2 týždne. Min. 4x vzostup titra potvrdzuje akútne ochorenie.
č. skúm.12345
sérum 1:10Agsérum
1:20Agsérum
1:40Agsérum
1:80Agfyziol.
roztokAg
O-9,120,5ml0,50,50,50,50,50,50,50,50,5
O-4,5,120,50,50,50,50,50,50,50,50,50,5
H-d0,50,50,50,50,50,50,50,50,50,5
H-b0,50,50,50,50,50,50,50,50,50,5
H-1,20,50,50,50,50,50,50,50,50,50,5
H-i0,50,50,50,50,50,50,50,50,50,5
H-g m0,50,50,50,50,50,50,50,50,50,5
výsledný
titer1:201:401:801:160
0,7 ml séra + 6,3 ml fyziologického roztoku (riedenie 1:10), prvá skúmavka 1
Do zbytku skúmavky č.1 3,5 ml riedenia 1:10 + 3,5 ml fyziologického roztoku, riedenie 1:20 druhá skúmavka 2
Do zbytku skúmavky č.2 3,5 ml riedenia 1:20 + 3,5 ml fyziologického roztoku, riedenie 1:40 tretia skúmavka 3
Do zbytku skúmavky č.3 3,5 ml riedenia 1:40 + 3,5 ml fyziologického roztoku, vznikne riedenie 1:80 – štvrtá skúmavka 4
Skúmavky s O Ag inkubujeme pri 50°C/18 hod.
Skúmavky s H Ag inkubujeme 2 hod./50°C a potom 18 hod./ 20°C
Hodnotenie reakcie:
1.Negatívna kontrola musí byť negatívna.
2.Aglutinácia O antigénov je zrnitý neroztrepateľný aglutinát. Hodnotíme najvyšší titer v ktorom ešte je aglutinácia.
3.Aglutinácia s H antigénov je chumáčikovitý roztrepateľný aglutinát.
