Úloha: Vyšetrenie hemoglobínu z krvi oviec
Princíp elektroforézy: Elektroforéza je delenie látok v elektrickom poli jednosmerného elektrického prúdu. Medzi elektródami je umiestnené nosné médium (roztok, papier, agarový, škrobový alebo polyakrylový gél), v ktorom sa komplexná látka rozdelí na jednotlivé zložky. Pri určovaní polymorfizmu bielkovín sa najčastejšie používa škrobový gél, ktorý sa pripraví rozvarením čiastočne hydrolyzovaného zemiakového škrobu vo vhodnom pufrovom roztoku a jeho následným tuhnutím.
Potrebné komponenty:
1. krvné sérum
2. filtračný papier
3. škrobový gél
4. elektródy
5. tenký drôtik
6. farbivo
7. odfarbovací roztok
Pracovný postup: Komplex bielkovín (krvné sérum) sa nasaje na kúsok filtračného papiera a vloží a do gélu. Gél sa vodivým spôsobom (pomocou filtračného papiera) spojí s pufrovým roztokom umiestneným v nádobách s elektródami. Pri zapojení jednosmerného elektrického prúdu dochádza spolu s elektrónmi k pohybu molekúl bielkovín obyčajne smerom do katódy k anóde. Pohyb jednotlivých bielkovín v géle závisí od veľkosti molekúl danej bielkoviny a od hodnoty elektrického náboja ich molekuly. Čas elektroforézy závisí od použitého napätia a prúdu, koncentrácie škrobu v géle, prierezu a dĺžky gélovej vrstvy, použitého farbiva.
Po ukončení elektroforézy sa gél pozdĺžne prereže jemným rybárskym vlasom alebo drôtikom a zafarbí a vhodným histochemickým farbivom, ktoré vytvorí s bielkovinou nerozpustný celok. Po odstránení prebytočného farbiva z gélu premývaním v odfarbovacích roztokoch môžeme detekovať určité bielkoviny ako farebné škvrny v rôznej vzdialenosti od štartu. Z konfigurácie bielkovinových škvŕn na géle je možné stanoviť polymorfizmus danej bielkoviny a určiť jej fenotyp.
Vyhodnotenie:
Z obrázku možno vidieť, že bielkoviny
+ - sa nadelili podľa veľkosti molekúl,
| - - | pričom molekuly krvnej skupiny B
| - - | boli väčšie ako molekuly krvnej
| | skupiny A a preto sa pri elektroforéze
| | dostali molekuly krvnej skupiny A
| | v géli ďalej.
| |
| |
_ _
fenotyp B AB A
Úloha: Izolácia DNA z krvi králikov
Princíp PCR: Polymerázová reťazová reakcia je proces in vitro syntézy definovaného špecifického úseku DNA vo veľkom množstve kópii. Na základe sekvencie DNA, ktorú chceme amplifikovať sú nasyntetizované dva oligonukleotidy, pričom každý z nich je komplementárny k sekvencii jedného reťazca dvojzávitnice na opačných koncoch úseku, ktorý má byť amplifikovaný. Tieto oligonukleotidy slúžia ako primery pre in vitro syntézu DNA. Množí sa iba úsek, okraje ktorého sú definované sekvenciou použitých primerov a ktorých veľkosť je presne známa a to do takého množstva kópii, ktoré je potom možné identifikovať priamo na agarózovom géle, po zafarbení etídium bromidom, pomocou UV transiluminátora. Reakcia prebieha v troch základných krokoch:
1. denaturácia – rozpletenie vlákien DNA pri teplote 90 – 95°C
2. annealing - hybridizácia oligoprimerov pri teplote 55 – 65°C
3. elongácia - amplifikácia špecifických úsekov DNA pri teplote 70 – 72°C
Potrebné komponenty:
1. genómová DNA ako templát
2. 2 oligonukleotidové primery dlhé 17 – 30 bp
3. volné nukleotidy dNTP
4. termostabilná Taq polymeráza
5. pufor
6. Mg2+, H2O
Postup: V denaturačnej fáze je dvojvláknová DNA denaturovaná na dve jednovláknové templátové molekuly DNA. Nukleotidová sekvencia cieľovej molekuly nemusí byť známa, ale musia byť známe krátke sekvencie úsekov obidvoch koncov cieľovej amplifikovanej DNA.
Vo fáze annealingu primery hybridizujú na obidvoch stranách cieľovej DNA a riadia syntézu nových vlákien.
V každom cykle sa množstvo DNA zdvojnásobí a tým sa zdvojnásobí množstvo templátu pre nasledujúci cyklus. Dochádza k exponenciálnej amplifikácii – z každej molekuly pôvodného templátu je vytvorených 2n kópii, kde n je počet cyklov.
Vyhodnotenie:
