Potom sa Pasteur podrobí skúške na vysokú školu, ale výsledok je ešte horší ako pri maturite. Z väčšiny predmetov síce dosiahne dobré známky, ale z chémie ho označia za priemerného a preto odstúpi a venuje sa príprave na skúšky ešte jeden rok.Louis chcel totiž všetko robiť poriadne a naplno a nestačil mu jeho predošlý výsledok. Na ďalších prijímacích skúškach sa umiestni už na štvrtom mieste, s čím je veľmi spokojný.
Rodičom píše: „Pracujem denne 12 hodín. V École nie sú hodiny, ale tzv. konferencie, ktoré vedú najlepší parížsky profesori. Týždenne dva krát z Matematiky, dva krát z chémie a tri krát z fyziky. Okrem toho chodím aj do Sorbonny na prednášky z matematiky a chémie. Navyše každý utorok máme chemické cvičenia v laboratóriu, a denne strávim aj niekoľko hodín v dielni, kde fúkam sklo, sústružím, robím stolársku alebo zámočnícku prácu.. slovom všetko, čo je potrebné pri zhotovení laboratórneho zariadenia. Okrem toho som sa zapísal aj na angličtinu a nemčinu, lebo obidva jazyky sa mi môžu zísť...“
Keď bol raz Pasteur v knižnici, dostala sa mu do ruky kniha od nemeckého vedca Mitscherlicha v ktorom upozorňoval na zvláštny jav, správanie sa kyseliny vínnej a kyseliny hroznovej(racemickej).Mitschelich výskumami dokázal, že obe kyseliny majú totožný tvar, stavbu, zloženie, mernú hmotnosť i dvojlom svetla. Napriek tomu majú odlišné optické vlastnosti. Pasteur tvrdil:“V prírode sa nič nedeje bez príčiny – všetko má svoju príčinu. Ani kyselina vínna nemôže byť výnimkou.“ Louis vyhlási, že on túto záhadu vyrieši, aj keď si s ňou už dlhé roky nevedia poradiť ani najlepší vedci sveta. Nakoniec sa mu to však aj podarí.

Aj jeho otec, ktorý sa v mladosti naučil len čítať a písať, nemal základy nijakej vedy, si teraz kupuje knihy a pokúša sa pochopiť veci ktoré študuje jeho syn. Pri záverečných skúškach sa ukáže, aký veľký trémista je. Z prírodných vied dosiahne len priemerné výsledky a zatiaľ čo jeho spolužiaci získajú výhodné miesta, Pasteurovi ponúknu len prácu stredoškolského profesora do malého mestečka. Ujme sa ho však profesor, známy chemik, Antoine Jérôme Balard, ktorý už ako 25-ročný v skromnom laboratóriu objavil neznáme zákonitosti chémie. Prosí ministra aby prehodnotil Pasteurovo preloženie a tak sa Louis nakoniec nemusí sťahovať a ostáva naďalej v laboratóriách Ěcole Normale Supérieure. Neskôr aj tak preruší svoju prácu a zapojí sa do Februárovej revolúcie v roku 1848, ale nevydrží dlho a opäť sa vráti do svojho laboratória, kde sa zaoberá dimorfizmom: schopnosťou jednotlivých látok odlišne kryštalizovať.