Okrem iného asistoval talianskemu matematikovi Lucovi Paciolim v oslavovanej práci Divina proportione (1509).
Navštevovanosť ukazuje, že Leonardo mal v Miláne veľa žiakov, pre ktorých neskôr napísal texty neskôr zhromaždené ako Úvahy o maľovaní. Najdôležitejšie z jeho vlastných malieb počas obdobia v Miláne bola Madona v skalách, existujú de verzie tohto obrazu. (Momentálne sa jedna nachádza v Louvre a jedna v Londýnskej národnej galérii.) V rokoch 1495 až 1497 pracoval Leonardo na veľkolepom diele Posledná večera. Nanešťastie, jeho pokusné použitie oleja na suchú omietku (sadru) bolo technicky veľmi nestabilné a už v roku 1500 sa začalo jeho ničenie. Pokusy o opravu tohto diela sa robili už od roku 1726, ale bezúspešne. Obrat nastal až v roku 1977 po použití najmodernejších technológií na elimináciu najhorších poškodení. Napriek tomu, že mnoho z pôvodného povrchu už neexistuje, majestátnosť kompozície a úžasné zobrazenie postáv nám dáva aspoň nejakú predstavu o jeho zašlej kráse.
Počas dlhého pobytu v Miláne Leonardo vytvoril veľa malieb a kresieb (väčšina z nich sa stratila), náčrtkov divadiel, architektonickýh nákresov a modelov pre milánsku katedrálu.
Návrat do Florencie
V roku 1502 Leonardo vstúpil do služieb Romagnského vojvodu. Cesare Borgia bol tiež hlavným generálom Pápeža Alexandra VI. Vo funkcii hlavného architekta a inžiniera Leonardo dohliadal na stavbách pevností pápežových teritórií v strede Talianska. V roku 1503 sa stal členom komisie, ktorá mala za úlohu nájsť čo najvhodnejšie miesto pre uiestnenie mramorovej sochy Dávida, ktorú zhotovil taliansky sochár Michelangelo a tiež pracoval ako inžinier vo vojne proti Pise. Ku koncu roka začal zhotovovať návrh malieb per veľkú halu Palazzo Vecchio. Námetom bola bitka pri Anghiari, Florentské víťazstvo v vojne proti Pise. Nakeslil veľa kresieb dekorácií a dokončil náčrtok v plnej veľkosti, ale maľbu nikdy nedokončil. Nákres bol zničený v 17. storočí a kompozícia sa zachovala iba v kópiách, z ktorých asi najslávnejšia je tá, ktorú namaľoval flámsky maliar Peter Paul Rubena a je uložená v Louvri.
Počas druhého obdobia vo Florencii, Leonardo namaľoval veľa portrétov, ale najznámejším je bezpochyby Mona Lisa. Tento z najlepších portrétov aké kedy namaľoval, je tiaž známy ako La Gioconda, pomenovaná po priezvisku manžela modelky. Leonardo mal ku tomuto obrau zvláštny vzťah, pretože i ho brával na všetky jeho ďalšie cesty.

Ďalšie cesty a smrť
V roku 1506 sa Leonardo opäť vybral do Milána, na povolanie od jeho francúzskeho guvernéra, Charlesa d’Amboisea. Nasledujúci rok sa stal dvorným maliarom francúzskeho kráľa Ľudovíta XII, ktorý vtedy prebýval v Miláne.