Rozdelené proteíny sa potom elektroforeticky prenesú z gélu na pevný nosič, ktorým je najčastejšie nitrocelulóza.V druhej fáze testu sa sérum pacienta nechá reagovať s prenesenými proteínmi vírusu zachytenými na nitrocelulóze. Ak sú vírus-špecifické protilátky prítomné vo vzorke od vyšetrovaného, naväzujú sa na príslušné vírusové proteíny. Vzniknuté komplexy antigén-protilátka sa potom detegujú peroxidázou značenou protilátkou namierenou proti ľudskému imunoglobulínu. Po vyvolaní enzymatickej reakcie vzniká na nitrocelulóze hnedý prúžok zodpovedajúci určitému anitgénu vírusu, proti ktorému vzorka vyšetrovaného obsahovala príslušnú protilátku.
Materiál:
1. Polyakrylamidový gél s proteínmi vírusu HIV separovanými metódou SDS-PAGE.2. Blotovacia kyveta: Kyveta na elektroforetický prenos proteínov z gélu na nosič.3. Nitrocelulózový hárok.4. Čistiaca špongia.5. Filtračné papiere Whatman.6. Blotovací tlmivý roztok (34g glycín, 7,3 g TRIS, 600 ml metanol, 2400 ml H2O, pH 8,3)7. Trepačka.8. Vzorkový tlmivý roztok: fosfátom tlmený fyziologický roztok (PBS) + 0,03% Tween 20 + 3% hovädzí sérový albumín. Uskladňovať pri +4ºC; pred použitím zohriať na laboratórnu teplotu.9. Vzorka od vyšetrovaného: sérum, plazma, cerebrospinálna tekutina.10. Konjugát: peroxidázou značená protilátka proti ľudskému imunoglobulínu zriedená 1:50011. Chromogén (25 mg 3,3-diaminobenzidín rozpustiť v 50 ml PBS, pridať 10 μl 30% H2O2 a jemne premiešať).
Postup:
1. Namočte gél so separovanými proteínmi do blotovacieho tlmivého roztoku na 20-30 minút pri laboratórnej teplote.2. Zložte prenosovú jedotku (sendvič) v nasledovnom poradí:a) perforovaná platňab) čistiaca špongiac) filtračný papier Whatmand) géle) nitrocelulózaf) filtračný papier Whatmang) čistiaca špongiah) perforovaná platňa3. Prenosovú jednotku vložte do blotovacej kyvety naplnenej blotovacím tlmivým roztokom tak, aby nitrocelulóza bola obrátená smerom k anóde.4. Kyvetu napojte na jednosmerný konštantný prúd 170 mA na 1-4 hodiny.5. Nitrocelulózový hárok rozstrihajte na tenké prúžky v smere separácie proteínov.6. Namočte jeden prúžok do 2 ml vzorkového tlmivého roztoku, do ktorého prodajte 40 μl vzorky (séra) a inkubujte 1 hod. pri izbovej teplote za neustáleho trepania.7. Prúžok premyte trikrát v 3 ml vzorkového tlmivého roztoku.8. Prúžok po premytí namočte do zriedeného konjugátu a inkubujte 1 hod. pri izbovej teplote9. Prúžok premyte v 3 ml vzorkového tlmivého roztoku a potom ho namočte do 3 ml deionizovanej vody.10. K nitrocelulózovému prúžku pridajte 2 ml chromogénu a nechajte vyvolávať reakciu do 10 min.