1. ÚVOD
Polymerázová reťazová reakcia PCR (Polymerase Chain Reaction) je metóda, ktorá umožňuje amplifikáciu zmnoženie špecifických úsekov DNA in vitro polymerizáciou pri využití špecifického katalytického účinku DNA-polymerázy. Rozmnoženie sa realizuje cyklickým opakovaním celého procesu. PCR imituje prirodzený mechanizmus replikácie DNA, ktorý sa v organizme uskutočňuje počas každého cyklu delenia bunky. V priebehu niekoľkých hodín je možné získať jedno až niekoľkomiliónové zmnoženie hociktorého úseku DNA, ktorého sekvencia báz, alebo aspoň sekvencia obidvoch jeho koncových častí je známa (inak by nebolo možné zhotoviť primery )
Táto metóda spôsobila v molekulárnej genetike revolúciu,pretože je geniálne jednoduchá, veľmi rýchla a veľmi citlivá. Po prvý raz o nej referovali K. Mullis a spol v roku 1987.

2. PODSTATA PCR
Na uskutočnenie PCR je treba mať k dispozícií :
-vzorku DNA obsahujúcu sekvenciu s GI, ktorá sa má amplifikovať a chemicky vizualizovať,
-primery – štartéry,
-termostabilnú DNA polymerázu Taq
Tento druh polymerázy bol izolovaný z baktérie Thermus aquaticus, žijúcej v horúcich prameňoch a odtiaľ pochádza aj jej označenie Tag DNA polymeráza.
-prekurzory DNA – štyri deoxynukleozid trifosfáty dATP,dCTP,dGTP,dTTP,ktoré predstavujú základné stavebné jednotky pre syntézu
-pufer na vytvorenie slabo zásaditého prostredia, ktoré je nevyhnutné pre aktivitu DNA poly Taq

Princíp DNA amplifikácie spočíva v cyklickom opakovaní troch krokov, ktorými sú :
1.denaturácia - oddelenie obidvoch komplementárnych reťazcov daného úseku DNA zahriatím na 94°C
2.Hybridizácia (50°C) – naviazanie dvoch komplementárnych primerov po jednom na 3´ koniec obidvoch reťazcov rozmnožovaného úseku, získaných pri denaturácii. Primermi sú synteticky pripravené jednovláknové oligonukleotidy, ktoré majú sekvenciu komplementárnu k sekvenciám na 3´ konci obidvoch vlákien. Skladajú sa približne z 20 nukleotidov. Pomocou nich sa rozmnožovaný úsek DNA ohraničuje, čím umožní identifikáciu a súčasne slúžia ako štartéry na začatie 3. kroku.
3.Syntéza chýbajúceho komplementárneho úseku DNA (72°C) – jej začiatok predstavujú primery, od ktorých sa vlastná syntéza odvíja pripájaním jednotlivých komplementárnych nukleotidov. Syntéza prebieha pri optimálnej teplote 72°C.

Priebeh ďalších cyklov umožňuje opakovanie sledu uvedených teplôt (94°C, 50°C, 72°C), pričom novosyntetizované vlákna DNA slúžia ako materiál pre ďalšiu syntézu v nasledujúcich cykloch. Po približne 30 cykloch sa takto získa okolo 105 kópií PCR-produktu – vymedzeného úseku DNA.
Reakcie prebiehajú v termocykleroch, ktoré nastavujú optimálnu teplotu pre jednotlivé kroky.
Produkt PCR (amplifikovaný úsek DNA) sa detekuje elektroforeticky a vizualizuje sa priamo farbením (napr. striebrom), alebo pomocou hybridizácie so sondami značkovanými rádioizotopicky či farebne.

3. VÝHODY A NEVÝHODY PCR

Medzi výhody PCR, pre ktoré našla uplatnenie v medicíne patrí:

1.krátke trvanie celého vyšetrovacieho procesu (okolo 3 hodín), čo má veľký význam pre prenatálnu genetickú diagnostiku (výsledok je k dispozícii najneskôr 2. deň po dodaní vzorky).
2.veľká citlivosť – napr. odhalenie jedinej bunky infikovanej vírusom.
3.potreba malého množstva DNA – rádovo nanogramové množstvá, čo umožňuje napr. predimplantačnú diagnostiku z jedinej blastoméry, diagnostiku z buniek vlasovej cibulky a dokonca i z jednej spermie alebo somatickej bunky.
4.Vyšetrovaná DNA môže byť veľmi stará a značne degradovaná, takže možno použiť aj farebné chromozómové preparáty, parafínové bločky tkanív, zmrazené tkanivá (takto sa vyšetrila mitochondriálna DNA sibírskeho mamuta, zamrznutého pred 40 000 rokmi v Severnom ľadovom mori, alebo aj veľmi staré vzorky múmií, starých až 7 000 rokov. V týchto prípadoch sa tiež vyšetrila mitochondriálna DNA.
Medzi nevýhody PCR patrí nevyhnutnosť poznania sekvencií báz amplifikovaného úseku DNA alebo aspoň primerov, malé rozmery takto vytvorených produktov a aj veľmi vysoká citlivosť tejto metódy – kontaminácia hoci len jednou falošnou molekulou spôsobí falošnú pozitivitu reakcie.
4. NIEKTORÉ MOŽNOSTI VYUŽITIA PCR

PCR má široké spektrum využitia:
1.Humánna medicína
-prenatálna diagnostika genetických ochorení,
-onkológia
-analýza bezchybnosti krvi
-diagnostika infekčných chorôb,
-súdne lekárstvo,
-sporná paternita.
2.Poľnohospodárstvo
-syndróm malígnej hypertermie u ošípaných,
-kapa kazeín BLK (žiadúci vplyv na syrovatenie)
-určovanie pohlavia
3.Archeológia, historická antropológia, vývojová biológia
- genetické stromy
4.Genetický výskum a klinická genetika
-mapovanie génov
-detekcia mutácií
-identifikácia génov
-vytváranie nových sond
-screening heterozygotov v geneticky zaťažených populáciách

V klinickej genetike a v ostatných klinických disciplínach humánnej medicíny sa PRC využíva najmä na diagnostiku dedičných monogénových, resp.infekčných chorôb. V prvom prípade je cieľovou sekvenciou DNA zmenená mutáciou,v druhom cudzorodá DNA alebo RNA.
Detekcia infekčných baktérií je najlepšie rozpracovaná pri tuberkulóze. Možnosť PCR sa využila aj na dôkaz, že TBC bacily a teda tuberkulózu nepriniesli do nového sveta španielski kolonizátori. V pľúcnom tkanive zamrznutej múmie dievčaťa z kmeňa Inkov, objavenej horolezcami v roku 1995 na vrchole sopky Ampato v peruánskych Andách, ktorá bola ako rituálna obeť prinesená bohom v 15.storočí,sa touto metódou podarilo zistiť v jej pľúcnom tkanive pritomnosť TBC bacila. Pretože Španieli prišli do tejto oblasti až v roku 1 532, možno usudzovať, že dievča bolo infikované tbc bacilom ešte pred ich príchodom.
V súdnom lekárstve sa PCR uplatňuje najmä v kriminalistike- usvedčenie vraha napr.: zo zvyšku jeho pokožky, ktorá zostala za nechtami brániacej sa obete, z cibuliek vlasov a po pohlavnom zneuzití zo spermií ( sondy komplementárne k DNA sekvenciám chromozómu Y páchataľa )

Pozn.: Ako zaujímavosť, že etnická príslušnosť v ďalekej minulosti sa dá aj dnes zistiť, možno ukázať na tomto príklade.V roku 1991 sa našla v Tyrolsku, vysoko v horách, v oetzalskom ľadovci zamrznutá múmia človeka, ktorého smrť podľa dostupných vyšetrení nastala pred 5 300 rokmi. Na podklade molekulárnych analýz v mitochondriálnej DNA pomocou PCR ( mt DNA je v tomto prípade vhodnejšia ako nukleárna, pretože z jej veľkého počtu kópií v bunkách je oveľa vyšší predpoklad získať nepoškodenú vzorku) sa zistilo, že tento jedinec nepochádzal z tamojšieho oetzalského etnika, ale sekvencia jeho mt DNA sa zhoduje s mt DNA dnešných severných Európanov.

	Tento článok bol vytlačený zo stránky https://referaty.centrum.sk

PCR -polymerázová reťazová reakcia