referaty.sk – Všetko čo študent potrebuje
Václav
Pondelok, 28. septembra 2020
PCR -polymerázová reťazová reakcia
Dátum pridania: 31.10.2005 Oznámkuj: 12345
Autor referátu: all1
 
Jazyk: Slovenčina Počet slov: 842
Referát vhodný pre: Vysoká škola Počet A4: 3.6
Priemerná známka: 2.98 Rýchle čítanie: 6m 0s
Pomalé čítanie: 9m 0s
 
1. ÚVOD
Polymerázová reťazová reakcia PCR (Polymerase Chain Reaction) je metóda, ktorá umožňuje amplifikáciu zmnoženie špecifických úsekov DNA in vitro polymerizáciou pri využití špecifického katalytického účinku DNA-polymerázy. Rozmnoženie sa realizuje cyklickým opakovaním celého procesu. PCR imituje prirodzený mechanizmus replikácie DNA, ktorý sa v organizme uskutočňuje počas každého cyklu delenia bunky. V priebehu niekoľkých hodín je možné získať jedno až niekoľkomiliónové zmnoženie hociktorého úseku DNA, ktorého sekvencia báz, alebo aspoň sekvencia obidvoch jeho koncových častí je známa (inak by nebolo možné zhotoviť primery )
Táto metóda spôsobila v molekulárnej genetike revolúciu,pretože je geniálne jednoduchá, veľmi rýchla a veľmi citlivá. Po prvý raz o nej referovali K. Mullis a spol v roku 1987.

2. PODSTATA PCR
Na uskutočnenie PCR je treba mať k dispozícií :
-vzorku DNA obsahujúcu sekvenciu s GI, ktorá sa má amplifikovať a chemicky vizualizovať,
-primery – štartéry,
-termostabilnú DNA polymerázu Taq
Tento druh polymerázy bol izolovaný z baktérie Thermus aquaticus, žijúcej v horúcich prameňoch a odtiaľ pochádza aj jej označenie Tag DNA polymeráza.
-prekurzory DNA – štyri deoxynukleozid trifosfáty dATP,dCTP,dGTP,dTTP,ktoré predstavujú základné stavebné jednotky pre syntézu
-pufer na vytvorenie slabo zásaditého prostredia, ktoré je nevyhnutné pre aktivitu DNA poly Taq

Princíp DNA amplifikácie spočíva v cyklickom opakovaní troch krokov, ktorými sú :
1.denaturácia - oddelenie obidvoch komplementárnych reťazcov daného úseku DNA zahriatím na 94°C
2.Hybridizácia (50°C) – naviazanie dvoch komplementárnych primerov po jednom na 3´ koniec obidvoch reťazcov rozmnožovaného úseku, získaných pri denaturácii. Primermi sú synteticky pripravené jednovláknové oligonukleotidy, ktoré majú sekvenciu komplementárnu k sekvenciám na 3´ konci obidvoch vlákien. Skladajú sa približne z 20 nukleotidov. Pomocou nich sa rozmnožovaný úsek DNA ohraničuje, čím umožní identifikáciu a súčasne slúžia ako štartéry na začatie 3. kroku.
3.Syntéza chýbajúceho komplementárneho úseku DNA (72°C) – jej začiatok predstavujú primery, od ktorých sa vlastná syntéza odvíja pripájaním jednotlivých komplementárnych nukleotidov. Syntéza prebieha pri optimálnej teplote 72°C.

Priebeh ďalších cyklov umožňuje opakovanie sledu uvedených teplôt (94°C, 50°C, 72°C), pričom novosyntetizované vlákna DNA slúžia ako materiál pre ďalšiu syntézu v nasledujúcich cykloch. Po približne 30 cykloch sa takto získa okolo 105 kópií PCR-produktu – vymedzeného úseku DNA.
Reakcie prebiehajú v termocykleroch, ktoré nastavujú optimálnu teplotu pre jednotlivé kroky.
Produkt PCR (amplifikovaný úsek DNA) sa detekuje elektroforeticky a vizualizuje sa priamo farbením (napr. striebrom), alebo pomocou hybridizácie so sondami značkovanými rádioizotopicky či farebne.

3. VÝHODY A NEVÝHODY PCR

Medzi výhody PCR, pre ktoré našla uplatnenie v medicíne patrí:

1.krátke trvanie celého vyšetrovacieho procesu (okolo 3 hodín), čo má veľký význam pre prenatálnu genetickú diagnostiku (výsledok je k dispozícii najneskôr 2. deň po dodaní vzorky).
2.veľká citlivosť – napr. odhalenie jedinej bunky infikovanej vírusom.
3.potreba malého množstva DNA – rádovo nanogramové množstvá, čo umožňuje napr. predimplantačnú diagnostiku z jedinej blastoméry, diagnostiku z buniek vlasovej cibulky a dokonca i z jednej spermie alebo somatickej bunky.
4.Vyšetrovaná DNA môže byť veľmi stará a značne degradovaná, takže možno použiť aj farebné chromozómové preparáty, parafínové bločky tkanív, zmrazené tkanivá (takto sa vyšetrila mitochondriálna DNA sibírskeho mamuta, zamrznutého pred 40 000 rokmi v Severnom ľadovom mori, alebo aj veľmi staré vzorky múmií, starých až 7 000 rokov. V týchto prípadoch sa tiež vyšetrila mitochondriálna DNA.
Medzi nevýhody PCR patrí nevyhnutnosť poznania sekvencií báz amplifikovaného úseku DNA alebo aspoň primerov, malé rozmery takto vytvorených produktov a aj veľmi vysoká citlivosť tejto metódy – kontaminácia hoci len jednou falošnou molekulou spôsobí falošnú pozitivitu reakcie.
 
   1  |  2    ďalej ďalej
 
Zdroje: Sršeň, Sršňová – Základy klinickej genetiky a jej molekulová podstata
Copyright © 1999-2019 News and Media Holding, a.s.
Všetky práva vyhradené. Publikovanie alebo šírenie obsahu je zakázané bez predchádzajúceho súhlasu.