Čistenie DNA izopropylalkoholom: DNA sa oddeľuje, kým RNA zostáva v roztoku. Fenolová extrakcia: DNA sa oddeľuje od RNA a to tým, že sa využíva závislosť uvoľnenia DNA od pH fenolového extrakčného roztoku. Zistilo sa, že ak pH fenolového roztoku je 6,0 do vodnej fázy prechádza len RNA, kým DNA je nerozpustná. Pri zvyšovaní pH prostredia, prechádza do roztoku i DNA a pri pH fenolového roztoku 7,4 možno DNA kompletne vyextrahovať do vodnej fázy extrakčného média.
Vzájomné oddelenie jednotlivých druhov NK: nízkomolekulové druhy RNA ( 4S a 5S ) a DNA možno oddeliť od vysokomolekulových RNA 3 mol.dm -3 etátom draselným pri pH 6,0 za 3 hodiny pri 0 oC. rRNA sa oddeľuje, kým 4S a 5S RNA a DNA zostávajú v roztoku. Prečistenie preparátov NK špeciálnymi postupmi: na oddelenie jednotlivých druhov NK a na ich prečistenie od rôznych interferujúcich prímesí sa využíva gélová filtrácia. Na izoláciu natívnych preparátov NK sa používa adsorbčná chromatografia na hydroxyapatite ktorá sa používa hlavne na oddelenie preparátov natívnej a denaturovanej DNA i na prípravu vysokočistej DNA z rôznych zdrojov.
Niektoré druhy NK možno kvalitne oddeliť i afinitnou chromatografiou pri ktorej, sa využívajú niektoré špecifické fyzikálno-chemické vlastnosti a štruktúrne charakteristiky NK.
Ďalším špeciálnym postupom je frakcionácia NK ultracentrifugáciou a to v sacharózových gradientoch, kde sa oddeľujú NK na základe rozličnej rýchlosti ich sedimentácie v odstredivom prostredí hustotového gradientu a v gradientoch chloridu cézneho, čo je jedna z najšetrnejších metód izolácie, purifikácie a frakcionácie preparátov DNA. Oddeľujú sa tu populácie DNA, ktoré sa líšia svojou hustotou a relatívnou molekulovou hmotnosťou. Uplatňuje sa tu stúpajúca hustota molekúl DNA zo zvyšujúcim sa obsahom guanínových a cytidínových nukleotidov. Natívna jednovláknová DNA má vyššiu hustotu ako natívna dvojvláknová DNA. Touto metódou možno oddeliť i termálne denaturovanú DNA od preparátu dvojvláknovej natívne DNA. V hustotovom gradiente chloridu cézneho možno oddeliť chromozómovú DNA od extrachromozómovej DNA, ktorá má vyššiu hustotu.
Izopyknickou centrifugáciou možno získať kvalitný preparát cirkulárnej DNA.
Metódy izolácie DNA
DNA sa uvoľní z pletiva spolu s RNA pri extrakcii pomocou p – aminosalicilátu, chloridu sodného, fenolkrezolovej zmesi a potom sa extrahuje 3 mol.dm -3 octanom sodným. DNA pripravená touto metódou je prakticky bez bielkovín a má sedimentačnú konštantu 16 až 18 S.
Chemikálie a roztoky :
A: 6 % vodný roztok sodnej soli p – aminosalicilátu
B: 1 % chlorid sodný
C: zmes fenolu a m – krezolu
500 g kryštalického fenolu predestilovaného
70 cm3 m – krezolu
55 cm3 vody
50 mg 8 hydroxychinolínu
D: chlorid sodný ( kryštalický )
E: zmes 95 % etanolu – m – krezolu ( pomer 9:1 )
F: 3 mol.dm-3 octan sodný, pH 6,0
G: 2 – etoxyetanol
H: 1 mol.dm-3 chlorid sodný
I: benzoan sodný v substancii
J: m- krezol
K:0,5 mol.dm-3 chlorid sodný v 0,3mol.dm-3 octane sodnom
L: 0,14 mol.dm-3 chlorid sodný v 0,015 mol.dm-3 citrane sodnom, pH 7,1
Pracovný postup:
1. Tkanivo sa zmrazí v kvapalnom dusíku, rozdrví sa na prášok a homogenizuje sa v trojnásobnom až štvornásobnom objeme roztokov A,B,C ( objemový pomer 1:1:1 )
2. Zmes sa mieša 20 minút pri teplote 20 oC, potom sa centrifuguje 30min. pri 600 g pri 5 oC
3. Vodná vrstva sa odsaje, pridá sa k nej kryštalický chlorid sodný ( 3 g na každých 100 cm3vodnejvrstvy )
4. Po rozpustení chloridu sodného sa k vodnej vrstve pridá polovičný objem roztoku C, zmes sa mieša 5 minút pri 20 oC a centrifuguje sa pri 8000 g 15 minút pri 5 oC.
5. Odoberie sa vodná vrstva, zmieša sa z dvoma objemami zmesi E a nechá sa stáť 30 – 60 minút pri 2 oC.
6. Vytvorený precipitát sa odcentrifuguje a ešte 2 krát sa premyje dávkami 25 cm3 roztoku F.
7. K spojeným supermatantom sa pridá rovnaký objem 2 – etoxyetanolu, precipitát sa odcentrifuguje a znovu sa rozpustí v roztoku H. Pridá sa benzoan sodný do výslednej koncentrácie 20 %, zmes sa dôkladne premieša a po rozpustení benzoanu sodného sa centrifuguje 90 minút pri 40 000 g pri 2 oC.
8. K supernatantnej frakcii sa pridá m – krezol ( 1/5 objemu supernatantnej frakcie ). DNA sa oddelí vo forme relatívnej hmoty a odcentrifuguje sa.
9. Želatínový sediment sa rozpustí v roztoku K a vyzráža sa rovnakým objemom 2 – etoxyetanolu.
10. Vytvorené vlákna DNA sa rozpustia v roztoku K a dialyzujú sa pri 2 oC oproti tomu istému roztoku.
11. Preparát DNA sa po dialýze uchováva rozpustený v roztoku K pri teplote – 30 oC.
Zaujímavosti o referátoch
Ďaľšie referáty z kategórie