1.3.2. Regenerácia rastlín v in vitro podmienkach

Podl'a spôsobu kultivácie rozoznávame:
Priamu regeneráciu, ktorá sa uskutočňuje na úrovni organizovaných pletív a zabezpečuje vyššiu genetickú stabilitu regenerantov.
Nepriamu regeneráciu, ktorá sa uskutočňuje cez štádium kalusu a vyznačuje sa nízkou genetickou stabilitou regenerantov.
Všeobecne môžeme povedať, že rastlinné explantátové kultúry zahrňujú izoláciu buniek, pletív, orgánov a ich kultiváciu v aseptických podmienkach v kontrolovanom prostredí /definované kultivačné médium, teplota, vlhkosť, kvalita a intenzita svetla/ Explantátom môže byť rastlinný orgán / koreň, výhon, púčik, kotyledóny, ihlice/, meristematické pletivo /vegetačné vrcholy/, ale aj jednotlivé bunky, ktoré sa pestujú oddelene od materského organizmu v podmienkach in vitro.
Z klasických prác je známe, že organogenéza je kontrolovaná pomerom rastových regulátorov /fytohonnónov/ v médiu.
Fytohormóny sú látky, ktoré sa vo veľmi nepatrných množstvách tvoria v jednotlivých orgánoch rastliny, prúdením ktorých je zabezpečovaná metabolická a rastová celistvosť rastliny.Rastové hormóny povzbudzujúce rast rastliny sa nazývajú stimulátory.
Látky brzdiace rast sú inhibítory. Tie rastové látky, ktoré si rastlina sama tvorí sú prirodzené /endogénne/ rastové hormóny.Známe sú aj syntetické hormóny pripravované chemicky. K rastovým hormónom typu stimulátorov patria auxíny, giberelíny a cytokiníny. K inhibítorom patrí kyselina abscisová a fenolické látky.
V pletivových kultúrach sa uplatňujú hlavne dve skupiny rastových látok
-auxíny a cytokiníny.

Auxíny sú rastové regulátory ovplyvňujúce predlžovanie buniek, hlavne vo výhonoch.Sú zodpovedné za apikálnu dominanciu stonky, podporujú rast adventívnych koreňov.
Medzi hlavné prirodzené auxíny patrí kyselina (3-indolyloctová /IAA/ , kyselina 4 chlorindolyloctová, kyseliny fenyloctová a indolylbutyloctová. K syntetickým auxínom patria kyselina [3indolyl-i-maslová /IBA/, a-naftyloctová /NAA/ a 2,4-dichlórfenoxyoctová /2,4-D/.
Cytokiníny sú rastové regulátory, ktoré podporujú delenie buniek.Regulujú rast a vývin.Stimulujú zakladanie púčikov, spomaľujú proces stárnutia a odd'aľujú nástup dormancie .V pletivových kultúrach zvyšujú mitotickú aktivitu.
Medzi prirodzené cytokiníny patrí zeatín, ktorý bol prvý krát izolovaný z nezrelého zrna kukurice.Najčastejšie experimentálne používané syntetické cytokiníny sú kinetin a 6 benzylaminopurin (Gajdošová 1995).
Médium pre indukciu výhonkov by malo mat' relatívne nízky obsah auxínov a vysoký obsah cytokinínov.
Médium pre indukciu koreňov by malo mat' vysoký obsah auxínov a nízky obsah cytokinínov. Médium pre indukciu kalusu by malo mat' vyrovnanú hladinu auxínov a cytokinínov.

Napriek platnosti určitých všeobecných princípov v kultivácii a regenerácii rastlinných pletív, treba konštatovat', že neexistuje všeobecne použiteľné kultivačné médium, ale naopak, optimálne podmienky kultivácie pre jednotlivé rastlinné druhy, kultivary a dokonca jednotlivé genotypy je potrebné zistit' experimentálne.
Kultúry pletív z dospelých jedincov sú všeobecne menej citlivé a menej reagujúce v podmienkach in vitro ako kultúry pletív z mladých jedincov.
Klonálne množenie in vitro môže byt' dosiahnuté viacerými prístupmi:
- indukciou vývinu výhonkov z terminálnych a axilárnych púčikov
-produkciou a vývinom adventívnych púčikov a výhonlcov
- somatickou embryogenézou
- regeneráciou z izolovaných protoplastov
Regenerácia rastlín indukciou vývinu výhonkov z terminálnych a axilárnych púčikov má mnohé výhody. Púčiky obsahujú existujúce meristematické listové primordia, ktoré sú obalené vonkajšími šupinami, čo ul'ahčuje sterilizáciu materiálu.
Obsahujú tiež endogénne cytokiníny, ktoré sú potrebné na uskutočnenie morfogénnej reakcie.

Mikropropagácia pomocou priamej indukcie a vývinu adventívnych púčikov a výhonov je proces, ktorý pozostáva zo 4 presne definovaných štádií:
1. Indukcia adventívnych púčikov na explantáte na médiu s vysokým obsahom cytokinínu a nízkym obsahom auxínu.
2. Vývin výhonkov na médiu bez rastových regulátorov a následná multiplikácia výhonkov na médiu s vysokým obsahom cytokinínu a nízkym obsahom auxínu.
3. Zakoreňovanie nových výhonkov na médiu s vysokým obsahom auxínu.
4.Otužovanie rastlín - prenos rastlín z in vitro podmienok do in vivo podmienok.
Mikrorozmnožovanie pomocou nepriamej indukcie adventívnych púčikov /indulccia z kalusu/ je menej používanou technikou.
Najviac študovaným spôsobom mikrorozmnožovania v posledných rokoch je somatická embryogenéza, t.j. schopnost' tvorit' bipolárne štruktúry podobné embryám na povrchu explantátu /priama embryogenéza/ , alebo kalusu /nepriama embryogenéza/.
Schopnost' indukcie somatickej embryogenézy je silne geneticky kontrolovaná.Výhody somatickej embryogenézy sú v tom, že umožňuje produkciu vel'kého počtu rastlín, umožňuje vyhnút' sa problémom so zakoreňovaním výhonkov a skracuje čas potrebný pre získanie kompletnej rastliny.
Kultúry izolovaných protoplastov sa používajú pre produkciu somatických hybridov medzi rastlinnými druhmi, ktoré sú sexuálne inkompatibilné, alebo sú ťažko krížiteľné. Protoplasty sú zároveň vhodným nástrojom pre aplikáciu metód génového inžinierstva (Gajdošová 1995).

1.3.3. Indukcia kalusu

Kalus predstavuje súbor nediferencovaných buniek, ktoré sa pri vhodných kultivačných podmienkach neobmedzene dlho delia.Po zmene podmienok možno vyvolat' opätovnú diferenciáciu a získať celú rastlinu (Gajdošová 1995).
Rast kalusu je indukovaný umiestnením explantátu na médium a relatívne vysokou koncentráciou auxínu v prítomnosti nižšej koncentrácie cytokinínu, alebo bez neho. Odvodený kalus môže byt' d'alej kultivovaný na pevnom médiu alebo môže byt' použitý k odvodeniu suspenznej kultúry.
Vytvorený kalus je prenesený na médium s nižšou koncentráciou auxínu, kde dochádza k vytvoreniu orgánových základov. Často musí nasledovat' tretia fáza-zakoreňovanie (Dušková, Dušek 1997).
Kalusové pletivo prevedené z primárneho explantátu do pasážnej kultúry si môže neobmedzene dlho udržať svoju rastovú aktivitu, nie však všetky svoje východzie vlastnosti. Kultivačné podmienky pôsobia na populáciu kalusových buniek selekčným tlakom. Zvýhodňuje tie bunky, ktorým najlepšie vyhovuje a tie pomerne rýchlo v kultúre prevládnu.

Značná variabilita sa prejavuje v objeme buniek, v stupni ich vakuolizácie, v charaktere bunkovej steny a v karyologických znakoch.
Ďalšou zmenou v kultúre môže byt' strata jej morfogénnej schopnosti. Najskôr obvykle mizne schopnost' tvorit' pupene. Strata organogenetickej a embryogenetickej schopnosti bola pozorovaná pri mnohých kultúrach (Luštinec 1983).
Indukovat' kalusovú kultúru možno prakticky z každého druhu pletiva z dvojklíčnolistových rastlín. Primokultúra sa obyčajne kultivuje s prídavkom auxínov, hlavne tzv. tvrdších auxínov 2,4-D a NAA.
Kalusy podl'a zdroja primokultúry, druhu kultivačného média sa môžu líšit' vzhl'adom, kvalitou a farbou (Preťová 1995).

1.4. Faktory ovplyvňujúce regeneráciu v in vitro podmienkach

Z vonkajších faktorov, ktoré vplývajú na rast rastlín v in vitro, sú dôležité chemické a fyzikálne vlastnosti kultivačného média. Kultivačné médium má poskytnúť vo vhodnej forme zdroj uhlíka, dusíka, makroelementy, mikroelementy a stimulačné látky.
Má mat' optimálnu hodnotu osmotického potenciálu a pH, definovaný obsah a zloženie plynnej fázy v kultivačnej nádobe (Preťová 1995).

1.4.1.Kultivačné médiá

Kultivačné médium pozostáva z rôznych solí, makro a mikroelementov, z organických látok /vitamínov a rastových látok, cukrov, aminokyselín/
Do tzv.pevných médií sa obyčajne pridáva agar, fytogel atd'. Pestované kultúry potrebujú nevyhnutný prísun anorganických zložiek média. Tie, ktoré sú potrebné v relatívne väčšom množstve sa nazývajú makroelementy. Anorganické látky, ktoré sú potrebné v malých množstvách, sa nazývajú mikroelementy. Sem patria med', zinok, bór, železo a molybdén. Niekedy aj kobalt a jód.
Z týchto solí sa pripravujú tzv. zásobné roztoky a z nich sa aplikuje do média príslušné množstvo. Železo sa pridáva v chelátovej forme kvôli rozpustnosti. Okrem toho aj agar používaný na spevňovanie médií obsahuje niektoré mikroelementy.
Vitamíny sa do médií pridávajú iba v malých množstvách. Mnohí autori považujú

vitamín B 1 za esenciálny vitamín. Kyselina nikotínová /niacin/ a pyridoxin /B6/ stimulujú rast. Thiamín je nevyhnutný, ak sú cytokiníny v médiu v nízkej koncentrácii.Vitamíny sú obyčajne termolabilné, a preto je potrebné pridávat' ich do médií cez filter. Aminokyseliny sa obyčajne do kultivačných médií nepridávajú s výnimkou glycínu, ktorý je zložkou väčšiny kultivačných médií. Ak je potrebné pridat' do kultivačných médií dusík v organickej podobe, médium je možné obohatit' o kazein hydrolyzát, alebo kasaminovú kyselinu. Kazein hydrolyzát predstavuje zmes asi 18 aminokyselín.
Všetky pletivové kultúry vyžadujú prítomnosť cukrov pre zdravý rast. Cukry sú zdrojom energie pre rastlinné pletivá a aj zdxojom uhlíka. Skoro všetky rastlinné pletivá dobre reagujú na pridanie sacharózy. Sacharóza zároveň splňa úlohu osmotika. Osmotická hodnota médií ovplyvňuje aj regeneráciu a anatomickú stavbu regenerantov (Preťová 1974).
Pokial' sa nepracuje s tekutým médiom, používajú sa polotuhé alebo tuhé média. Väčšina stacionárnych kultúr sa pestuje na agarovom médiu. Agar sa používa v koncentrácii 0,6-1,0%. Okrem agaru sa používa aj agaróza a fytogel.
Výber kultivačného média závisí od typu rastlinného pletiva a od rastlinného druhu (Dedičová 1995).

1.4.2. Fyzikálne faktory sprevádzajúce pestovanie in vitro

Z vonkajších faktorov, ktoré vplývajú na rast kultúr v in vitro podmienkach, ide najmä o fyzikálne faktory akými sú teplota, hustota ožiarenia počas kultivácie a kvalita svetla.
Z fyzikálnych vlastností kultivačného média sú dôležité hlavne osmotická hodnota prostredia, kyslosť média, obsah a zloženie plynnej fázy v kultivačnej nádobe (Preťová 1995).
Hodnota pH má v biológii mimoriadny význam. Mnohé životné procesy ako napríklad enzymatické reakcie, príjem živín rastlinami prebiehajú iba pri určitom pH. Pod pojmom pH rozumieme koncentráciu voľných vodíkových iónov, ktorá určuje kyslost' alebo zásaditosť roztoku. Hodnoty pH sa pohybujú od 1 do 14, pričom hodnota pH=1 predstavuje veľmi kyslý roztok, pH=7 je hodnota neutrálneho roztoku a pH=14 je veľmi zásaditý roztok. Hodnoty pH meriame pH-metrom.
Dnes je k dispozícii celá škála týchto prístrojov.Pre prácu s nimi platí jedna všeobecná zásada , pred vlastným meraním prístroj treba nastaviť - kalibrovať pomocou štandartných roztokov.

Všetky typy pletivových kultúr s ohľadom na rastlinný druh, pôvod kultúry /orgánové,
protoplastové, bunkové/, ako aj typ kultúry /suspenzné, statické/ majú svoje špecifické nároky na kultivačné podmienky. Pri úspešnej kultivácii mnohých pletivových kultúr často býva limitujúcim faktorom vhodný svetelný a tepelný režim v kultivačnej miestnosti.
Ideálny spôsob kultivácie je použitie fytotrónu - kultivačnej komory s presne kontrolovateľnými a nastaviteľnými parametrami vhodnými pre kultiváciu príslušného rastlinného druhu (Dedičová 1995).