Využitie biotechnologických metód v množení rastlín

Biotechnológie, toto slovo biotechnológie je zložené z dvoch termínov : bio-život a technológia – náuka o technických veciach.
Biotechnológia je aplikácia vedeckých a inžinierskych princípov pre produkciu rôznych organických alebo anorganických látok pomocou biologických činiteľov, ktoré látky vytvoria,alebo pri ich tvorbe pomáhajú; biologický činiteľ zahrňuje aj biologickú katalýzu, príslušné mikroorganizmy, enzýmy, ako aj živočíšne a rastlinné bunky, alebo ich aktívne štruktúry.

Technológia in vitro kultúr
Základom rastlinného organizmu vznikajúceho pohlavným rozmnožovaním je jedna bunka – zygota, ktorá vznikne oplodnením vajcovej bunky spermatickou bunkou. Zygota je totipotentná a mitoticky sa delí. Na určitom stupni vývinu embrya sa bunky diferencujú a rozdelia si špecializované funkcie. Vzájomným pôsobením dedičných vlastností s vonkajšími podmienkami sa rastlina vyvíja, pričom sa diferencuje za vzniku špecifických štruktúr-pletív a jednotlivých rastlinných orgánov.
Diferenciáciou rozumieme získanie rozdielností ako v štruktúre tak aj vo funkcii buniek, ktorá je daná rozdielnou expresiou génov.
Prvými prejavmi diferenciácie je predlžovanie bunky a nerovnomerné bunkové delenie. Počas vývinu majú dôležitú úlohu v celom rastlinnom organizme korelácie medzi orgánmi a pletivami. Schopnosť rastliny regenerovať a vegetatívne sa rozmnožovať poukazuje na to, že jednotlivé časti sa vyznačujú veľkou autonómnosťou. Táto autonómnosť sa zakladá na totipotencii somatickej rastlinnej bunky. Pri rastlinnom organizme sa vychádza z toho, že nielen zygota je totipotentná, ale že totipotentná je ktorákoľvek živá rastlinná bunka. to znamená, že aj vysoko diferencovaná bunka obsahuje kompletnú genetickú informáciu a je schopná regenerovať mnohobunkovosť, štruktúru, sexualitu a fenotyp organizmu, z ktorého pochádza. Diferencované špecializované rastlinné bunky vykonávajú určité funkcie.
Zmenou podmienok, napríklad izoláciou špecializovaných buniek z rastliny a prenesením do vhodného média, môže nastať ich dediferenciácia a utvorí sa neorganizované kalusové pletivo.
Veľa cenných informácií o procese diferenciácie buniek bolo získaných na základe uplatnenia metódy kultivácie rastlinných buniek a pletív in vitro.
Metóda in vitro kultivácie umožňuje rast izolovaných častí rastliny-explantátov v definovaných kultivačných médiách v sterilnom prostredí a za regulovaných fyzikálnych podmienok /teplota a svetelný režim/.

1 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ
PROBLEMATIKY

1.1 Súčasnosť a budúcnosť biotechnologických metód

Dnes už je mnoho dôkazov, že pletivové kultúry predstavujú najrýchlejší a najspoľahlivejší spôsob rozmnožovania rastlín. To, čo priťahuje pozornosť pestovateľov, je najmä rýchlosť akou je možné množiť rastlinný materiál v in vitro podmienkach. Nemenej zaujímavý je aj obrovský potenciál pletivových kultúr, ktoré sa využívajú na skvalitnenie rastlín. Dnes je už ťažké nájsť rastliny, ktoré by sa pestovatelia nepokúšali pestovať v in vitro podmienkach.
Za posledné desaťročie sa vytvorili zásadné podmienky na využívanie explantátových kultúr ako novej metódy množenia a šľachtenia rastlín. Tieto techniky sa doplnili aj o ďaľšie, ktoré umožňujú ozdravovanie rastlinného materiálu od patogénov.

Tieto techniky môžu byť využité na prípravu obrovského počtu rastlín pri zachovaní nezmeneného rastlinného genómu. Z toho vyplýva, že rastliny budú mať presne tie isté charakteristiky ako má výchozia rastlina. Na druhej strane je možné využitím týchto tecník a základných znalostí získať rozšírenie a vyššiu plasticitu raslinného genómu ( napr. vyššia tolerancia k ochoreniu, zasoleniu a pod. (PREŤOVÁ, 1995 )
Problematika pletivových kultúr sa dotýka jedného základného princípu žýivota rastlín – schopnosti ich častí za vhodných podmienok samostatne žiť, rásť a vyvýjať sa. Táto schopnosť izolovaných buniek, pletív a orgánov bola využitá k spracovaniu metód regulácie rastových a diferenciačných procesov in vitro, ktoré dnes nachádzajú praktické uplatnenie v aplikovanej genetike a biotechnológii.
V rastlinnej ríši sa aplikujú kalusové pletivové kultúry v prípadoch keď sa má získať fytomasa obsahujúca cenné substancie, najmä na výrobu liečiv, pričom výskyt, alebo rast takejto fytomasy je v prírodných podmienkach nepostačujúci /žen-šen/

Rozšírené sú aj meristémové kultúry, ktoré umožňujú získať a rozmnožovať úplne sterilné, vírusov, baktérií a húb zbavené rastlinné druhy, čo má význam v pestovaní kvetov /ruže, gerbery, ľalie, tulipány, tropické kvety, orchidey/, liečivých a aromatických rastlín, ale aj technických plodín.
Hoci technika meristémových kultivácií využíva aj stimulátory rastu, je nezávislá od selekčných postupov využívajúcich génové manipulácie na zvýšenie odolnosti rastlín proti škodcom a zmenu ich úžitkových vlastností či zvýšenie výťažnosti, ale obe metódy sa môžu prelínať.

V živočíšnej ríši sa aplikujú bunkové kultúry založené na hybridómovej metodike. Tá je založená na spojení schopnosti rakovinových buniek neobmedzene sa rozmnožovať vo vhodnom živnom prostredí a schopnosti zdravých buniek produkovať farmaceuticky účinné látky. Fúziou oboch buniek sa dá vytvoriť nová bunka, ktorá je schopná rozmnožovať sa v umelom prostredí a súčasne tvoriť želané látky. Takto orientovaná biotechnológia buniek patrí do skupiny výroby liečiv.
Kultivácia živočíšnych pletív je pre ich morfologickú diferenciáciu obtiažna, ale pokroky sa dosahujú hlavne v oblasti embryonálnych štruktúr.
Biotechnologické metódy v súčasnosti významne ovplyvňujú technologické postupy, pretože rozširujú a urýchľujú možnosti rozmnožovania, selekcie a šľachtenia rastlín a drevín. Termín biotechnológií nie je nový, široko sa používal už na začiatku nášho storočia.
Explantátové kultúry ako techniky in vitro nachádzajú uplatnenie v oblasti teoretického výskumu a zároveň sú niektoré postupy využívané i prakticky.

Murashige /1974/ predpokladal štyri oblasti využitia pletivových kultúr :
o-produkcia látok pre farmaceutický priemysel
o-zlepšenie genetických vlastností rastlín
o-ozdravovanie klonov a ochrana germa plazmy
o-rýchla multiplikácia druhov a odrody
V súčasnosti sa napĺňajú ďalšie, v tom čase netušené možnosti
-génové inžinierstvo
-komerčné využitie

Rastlinný explantát predstavuje izolovanú, životaschopnú časť rastlinného organizmu, ktorá sa pestuje v podmienkach in vitro. Pojem explantát pochádza z talianskeho „ex plantare“, čo znamená pestovať mimo. Mimo materského organizmu, in vitro = v skle
Rastlinné bunky sú za určitých podmienok schopné vytvoriť celú rastlinu z jednej ,alebo niekoľkých somatických buniek. Vytvorené regeneranty môžeme spätne využiť na odber explantátov a celý pokus rozmnožovania sa týmto opakuje. Táto schopnosť, ktorá vychádza z totipotencie buniek, tvorí základ pre praktické použitie rastlinných explantátov. Totipotencia je charakteristickou vlastnosťou každej somatickej bunky, pričom najvýraznejšia je v bunkách meristému.
o všeobecnosti platí, že rozmnožovanie rastlín metódami explantátových kultúr pozostáva zo série metodických postupov, výsledkom ktorých je regenerovaná rastlina. Na druhej strane je potrebné vedieť, že neexistuje všeobecné pravidlo, či univerzálny postup, ktorý by bolo možné prijať ako návod pre úspešnú mikropropagáciu. Využitie pletivových kultúr v šľachtení rastlín možno rozdeliť do dvoch principiálnych oblastí :

1.Techniky, umožňujúce krátkodobé, resp. Dlhodobé uchovávanie rastlín v kultúre in vitro bez významnejších zmien pre potreby vegetatívneho množenia
2.Techniky indukcie genetickej variability najčastejšie využívané ako krátkodobý medzistupeň konkrétnej šľachtiteľskej metódy

Techniky zachovávajúce pôvodný genotyp:
·meristémové kultúry
·embryokultúry
·klonovanie in vitro

Techniky zachovávajúce pôvodný geenotyp:
a; meristémové kultúry :meristém pre založenie kultúry in vitro definoval HOLLINGS /1965/ ako štruktúru, obsahujúcu vlastný apikálny meristém s 1-2 pármi listových primordií. Pre tento typ kultúry sa bežne používa označenie meristémová kultúra. Pre rast izolovaných meristémov sú vhodné najbežnejšie kultivačné médiá jako B5, MS / Murashige, Skoog,1967/ Na médiách bez pridania rastových regulátorov sa vyvýja z meristému jeden výhon. Veľký vplyv na vývin meristémov majú cytokiníny. Odstraňujú inhibičný účinok apikálneho vrcholu na axilárne púčiky a stimulujú ich rast, meristémová kultúra potom nadobúda charakter mnohonásobných výhonkov. Najpoužívanejší cytokinín je BAP/ 6-benzylaminopurín/, ktorý je najčastejšou zložkou kultivačných médií vo fáze novovytvárania buniek /proliferácia/
Nesmierne cenným výledkom meristémových kultúr je eliminácia výrusových ochorení. Platí všeobecná zásada : čím je menší explantát, tým je vyššia pravdepodobnosť získania zdravého jedinca. Produktom meristémovej kultúry je fenotypovo, homogénne a geneticky stabilné potomstvo.

b; embryokultúry : RAGHAVAN /1980/ rozdelil embryokultúry do dvoch kategórií:
1.Kultúra semenných embryí, při ktorej sa ako explantát používa plne vyvinutá bipolárna štruktúra, obsahujúca koreňový aj stonkový meristém
2.Kultúra proembryí, čo je kultivácia všetkých nezrelých zárodkov ešte pred vyvinutí kotyledonov.
Zásadný rozdiel spočíva v tom, že staršie embryá sú po vyvinutí klíčnych listov autotrofné, kým obyčajné proembryá sú heterotrofné. Tento fakt sa prejaví aj v kultúre. Staršie embryá majú nižšie nároky na zloženie kultivačného média. Plne vyvinuté embryá sú schopné klíčiť na veľmi jednoduchých médiách /minerálne soli a sacharóza/. Mladšie embryá vyžadujú vyššiu osmotickú hodnotu média, napr. Globulárne ľanové proembrya až 12% sacharózy.
Podľa PIERIKA /1987/ embryokultúry slúžia na :
·elimináciu absolútnej inhibície klíčenia
·skrátenie šľachtiteľského cyklu skrátením, či vylúčením obdobia dormancie
·prevencia aborcie embryí
·vegetatívne rozmnožovanie

c; klonovanie in vitro : roznačuje sa aj ako mikropropagácia.Rozmnožovanie in vitro prebieha:
a/ indukciou axilárnych meristémov pri kultivácií izolovaných vrcholov /meristémové kultúry/
b/ tvorbou adventívnych meristémov a púčikov pri kultivácií orgánov alebo ich častí
c/ diferenciáciou rastlín procesom organogenézy alebo somatickej embryogenézy v podmienkach kalusových a bunkových kultúr.
Klonovanie in vitro rozdelil MURASHIGE /1978,1979/ do štyroch fáz /2-5/, no neskôr sa ku nim pridala i ďalšia fáza /1/ často označovaná aj ako nultá :
1.zahŕňa prípravu východiskového materiálu v optimálnych pestovateľských podmienkach, s radou fytosanitárnych opatrení
2.izolácia explantátu a jeho zavedenie do kultúry in vitro .Jej úlohou je zabezpečiť nekontaminovaný rast a vývin explantátu
3.vlastné rozmnožovanie – hlavným zmyslom tejto fázy je docieliť masové rozmnoženie bez straty genetickej stability, výber pracovnej metódy sa prispôsobuje rastlinnému druhu a explantátu

4.ukončenie tvorby axilárnych výhonkov, ich predlžovanie a zakoreňovanie.
Zvýšená intenzita svetla ja príprava výhonkov a rastlín z predchádzajúcej fázy na prenos do pody. Obsahuje významným adaptačným faktorom pre prechod od heterotrofnej k autotrofnej výžive
5.prenos rastlín do nesterilných podmienok a ich dopestovanie v pôde

Techniky zvyšujúce genetickú variabilitu

Bunky trvalých pletív explantátu izolované z celistvej rastliny a prenesené na kultivačné médium sa po určitej adaptačnej fáze začnú deliť. Mitotické delenie je obmedzené len na povrchové vrstvy buniek. Proces pri ktorom diferencované bunky trvalého pletiva prechádzajú do meristematického stavu sa považuje za dediferenciáciu. Výsledkom dediferenciácie in vitro je vytvorenie heterogénneho systému, ktorý má schopnosť spätnej diferenciácie na organizovanú štruktúru.
Kalusové pletivo, bunková kultúra i protoplastová kultúra je vlastne neorganizovaná explantátová kultúra. Je to nerovnorodý systém zložený z buniek rôzneho stupňa diferenciácie, s rozličnou morfogenetickou kompetenciou a rôznou reakciou na vonkajší morfogenetický signál /BEŽO,1995/
Medzi techniky rozširujúce genetickú variabilitu patria :
a; kalusové kultúry: kalus možno indukovať z každého druhu pletiva rastliny. Primokultúra sa najčastejšie kultivuje na médiu s prídavkom auxínov, alebo cytokinínov. V ďalších pasážach sa používa to isté médium ale zo zníženou koncentráciou fytohormónov. Kalusy sa podľa zdroja primokultúry, druhu kultivačného média sa môžu líšiť vzhľadom, kvalitou a farbou.
Kalus – pletivo, ktoré rastie neorganizovane bez zreteľnej polarity a usporiadania existujúceho vo vyvinutej rastline, ale dochádza k diferenciácií buniek
b; bunkové /suspenzné/ kultúry: zakladajú sa z tzv. rozpadavých kalusov, prenesených do tekutého kultivačného média
c; protoplastové kultúry: protoplasty sa získavajú z rôznych typov pletív rastlín a kultúr ich vystavením pôsobeniu celulytických a pektolytických enzýmov.Každý kultivovaný protoplast vytvorí po odstránení enzýmov bunkovú stenu. Bunky sa začnú deliť, každý protoplast vytvorí kolóniu intaktných buniek, z ktorých vznikne embryoid alebo mikrokalus a neskôr kalus
1.2 Rastlinné explantáty, ich význam a perspektívy využitia

Rastlinné orgány, pletivá a bunky možno pestovať aj oddelene od materského organizmu, v podmienkach in vitro kultúry ( Opatrný 1983 ).
Základom ich pestovania je skutočnosť, že každá živá rastlinná bunka/pohlavná i somatická/ je totipotentná. Vďaka svojej totipotencii sú rastlinné bunky v podmienkach kultivácie in vitro schopné obnoviť fázu delenia a v závislosti na vplyve okolitého prostredia /podmienok kultivácie/dosiahnuť určitého stupňa diferenciácie, prípadne regenerácie celej rastliny ( Dušková, Dušek 1997 )
Kultivácia rastlín alebo ich časti v podmienkach in vitro vychádza z týchto princípov :
- veľké populácie buniek možno dlhodobo kultivovať a za kontrolovaných podmienok regenerovať rastliny
- kultúra organizovaných štruktúr ( meristémov, embryí ) – systém vysokej genetickej stability
- bunková kultúra je zdrojom genetickej variability / rastlinné bunky v in vitro podmienkach sú geneticky a chromozomálne nestabilné/, ktorú možno zvýšiť pri použití mutagénov in vitro. – kultúra organizovaných štruktúr /meristémov, embryí/-systém vysokej genetickej stability umožňuje hromadne množiť geneticky identické potomstvo-klonovať in vitro
- bunková populácia umožňuje selektovať bunky nesúce špecifickú genetickú zmenu /mutáciu/
- populácia odvodená z haploidných buniek / napr.peľových zŕn/ zvyšuje pravdepodobnosť zachytenia recesívnych mutácií

Spôsoby regenerácie :
- regenerácia priama – vychádza z diferencovaných pletív /púčiky,výhonky a pod./
-regenerácia nepriama – vychádza z nediferencovaných pletív, alebo buniek / kalusy /
Kultúry rastlinných explantátov možno podľa morfologickej, resp. anatomickej charakteristiky zaradiť do niektorej z nasledujúcich 5 tkategórií :
1.kultúra orgánová- predstavuje orgánové systémy, orgány, resp. ich časti kultivované v podmienkach in vitro spôsobom, ktorý umožňuje ich diferenciáciu a v celku zachováva ich stavbu a funkciu
2.Kultúra pletivová- predstavuje do rôzneho stupňa súdržné morfologicky dezordanizované komplexy pletiva, rpzmnožované na pevnej či tekutej živnej pôde.
3.Kultúra suspenzná- predstavuje voľné bunky a bunkové zhluky rozmnožované v tekutej živnej pôde, premiešavané a prevzdušňované
4.Kultúra bunková- predstavuje voľné, jednotlivé a identifikovateľné bunky, resp. ich najbližšie potomstvo rozmnožované v tekutej, alebo polotekutej pôde , alebo nosiči nasýtenom pôdou.

5.Kultúra protoplastov- predstavuje nahé rastlinné bunky, u ktorých bola mechanickým alebo enzymatickým procesom odstránená bunková stena. Vonkajšia plazmatická membrána je úplne odhalená a je bariérou medzi vonkajším prostredím a vnútorným prostredím bunky ( DUŠKOVÁ, DUŠEK,1997 )
Začlenením metód explantátových kultúr do šľachtiteľského a semenárskeho procesu sa dosahuje predovšetkým :
a; rýchle množenie cenných rastlinných genotypov, vzniknutých šľachtiteľskou činnosťou a tým aj rýchlejšia tvorba nových výkonnejších odrôd
b; ozdravenie šľachtiteľských materiálov od patogénov, najmä od výrusov a tým dosahovanie vyšších úrod a nižších strát
c; prekonanie nekrížiteľnosti systematicky vzdialených rastlinných taxónov a umožnenie vyšľachtenia nových genotypov poĺnohospodárskych a záhradníckych plodín a nových odrôd s významnými hospodárskymi znakmi a vlastnosťami
d; dlhodobé udržiavanie genetických zdrojov v kultúre in vitro
e; možnosť indukcie vzniku haploidných a polyploidných organizmov využitím premenlivosti rastlinných pletív a tým možnosť získania nových odrôd poľnohospodárskych a záhradných plodín v kratšom čase
f; možnosť využitia predselekcie v kultúrach in vitro umožňuje skvalitnenie rastlín
g; získanie nových a udržanie existujúcich genotypov s peľovou sterilitou a tým možnosť podstatne skrátiť šľachtiteľský proces
h; možnosť produkcie haploidov androgenézou a gynogenézou in vitro a tým rýchlejšie získanie nových odrôd
i; možnosť konštrukcie úplne nových genotypov kultúrnych rastlín (Preťová 1995).

Veľmi dôležitým a z praktického hľadiska nesmierne cenným dôsledkom meristémových kultúr je eliminácia vírusových ochorení. Platí všeobecná zásada : čím menší je primárny explantát, tým väčšia je pravdepodobnosť odvodenia bezvirózneho jedinca. Vírusy v rastline nie sú rozložené rovnomerne. V meristémoch sa vírusy nenachádzajú, pretože je tu intenzívne delenie buniek a absentuje tu výskyt vaskulárnych elementov a to znemožňuje množenie a transport vírusov. Neskôr sa zistilo, že niektoré vírusy napádajú aj meristém. Na ich likvidáciu sa využíva termoterapia.
Klonové množenie in vitro sa okrem komerčných laboratórií začína veľmi využívať aj v šľachtiteľskom procese. Niektoré zo šľachtiteľských materiálov je vhodné udržovať a rozmnožovať in vitro, napr. sexuálne sterilné rastliny – haploidy, sterilné mutanty, zriedkavé aneuploidy, alebo rastliny s neobvyklou kombináciou chromozómov, ktoré sa môžu stratiť pri generatívnom rozmnožovaní. Špecifické heterozygotné kombinácie génov, t.j. zložité hybridné genotypy, ktoré je obtiažne získať krížením – celý sortiment povolených odrôd, perspektívne novošľachtence a niektoré genetické zdroje.

1.3 Spôsoby rozmnožovania rastlín

U rastlín rozoznávame dva druhy rozmnožovania – pohlavné / generatívne / a nepohlavné / vegetatívne /. Teoreticky sa všetky rastliny môžu rozmnožovať vegetatívne, častejši je však generatívny spôsob rozmnožovania

1.3.1. Vegetatívne spôsoby rozmnožovania

Vegetatívne rozmnožovanie je spôsob rozmnožovania rastlín pomocou vegetatívnych
orgánov, izolovaných somatických buniek, prièom sa zachovávajú pôvodné genetické
vlastnosti rastlín.
Potomstvo získané vegetatívnym rozmnožovaním sa nazýva klon.Okrem toho, že
vegetatívne množenie je účinnou množitel'skou metódou, stalo sa aj súčast'ou šl'achtenia.
V princípe sú možné tri spôsoby vegetatívneho množenia rastlín:
1. štepenie alebo očkovanie/heterovegetatívne množenie/
2. rezkovanie a zakoreňovanie rezkov/autovegetatívne množenie/
3. produkcia rastlín pomocou pletivových kultúr/mikrorozmnožovanie/

1. Štepenie a očkovanie je široko využívaná metóda vegetativneho rozmnožovania rastlín zvlášt' u drevín v semenných sadoch.
2. Úspešnost' zakoreňovania odrezkov odoberaných z rôznych častí rastlín je závislá na viacerích faktoroch:
- genotyp danej rastliny
- fyziologický stav odrezkov-životaschopný a zdravý materiál s vysokým množstvom živín má väčší predpoklad na zakorenenie. Fyziologický stav materiálu je ovplyvnený sezónou v čase odoberania materiálu, klimatickými podmienkami a podmienkami pestovania donorovej rastliny.
3. Podl'a typu východzieho explantátu rozoznávame viac typov in vitro kultúr:
Embryokultúry - kultúry izolovaných embryí rôzneho stupňa vývinu, ktoré sa často používajú k produkcii inak inkompatibilných hybridov.
Meristémové kultúry - kultúry vrcholovej delivej /meristémovej/ zóny púčikov.
Významné sú z hľadiska množenia bezvírusového rastlinného materiálu.Pomocou meristémových kultúr boli ozdravené mnohé kultivary ovocných drevín /jablone, hrušky, figy, grapefruity/.
Orgánové kultúry - aseptické kultúry celistvých rastlinných orgánov, v ktorých sa udržuje ich pôvodná forma (GAJDOŠOVÁ, 1995).
1.3.2. Regenerácia rastlín v in vitro podmienkach

Podl'a spôsobu kultivácie rozoznávame:
Priamu regeneráciu, ktorá sa uskutočňuje na úrovni organizovaných pletív a zabezpečuje vyššiu genetickú stabilitu regenerantov.
Nepriamu regeneráciu, ktorá sa uskutočňuje cez štádium kalusu a vyznačuje sa nízkou genetickou stabilitou regenerantov.
Všeobecne môžeme povedať, že rastlinné explantátové kultúry zahrňujú izoláciu buniek, pletív, orgánov a ich kultiváciu v aseptických podmienkach v kontrolovanom prostredí /definované kultivačné médium, teplota, vlhkosť, kvalita a intenzita svetla/ Explantátom môže byť rastlinný orgán / koreň, výhon, púčik, kotyledóny, ihlice/, meristematické pletivo /vegetačné vrcholy/, ale aj jednotlivé bunky, ktoré sa pestujú oddelene od materského organizmu v podmienkach in vitro.
Z klasických prác je známe, že organogenéza je kontrolovaná pomerom rastových regulátorov /fytohonnónov/ v médiu.
Fytohormóny sú látky, ktoré sa vo veľmi nepatrných množstvách tvoria v jednotlivých orgánoch rastliny, prúdením ktorých je zabezpečovaná metabolická a rastová celistvosť rastliny.Rastové hormóny povzbudzujúce rast rastliny sa nazývajú stimulátory.
Látky brzdiace rast sú inhibítory. Tie rastové látky, ktoré si rastlina sama tvorí sú prirodzené /endogénne/ rastové hormóny.Známe sú aj syntetické hormóny pripravované chemicky. K rastovým hormónom typu stimulátorov patria auxíny, giberelíny a cytokiníny. K inhibítorom patrí kyselina abscisová a fenolické látky.
V pletivových kultúrach sa uplatňujú hlavne dve skupiny rastových látok
-auxíny a cytokiníny.

Auxíny sú rastové regulátory ovplyvňujúce predlžovanie buniek, hlavne vo výhonoch.Sú zodpovedné za apikálnu dominanciu stonky, podporujú rast adventívnych koreňov.
Medzi hlavné prirodzené auxíny patrí kyselina (3-indolyloctová /IAA/ , kyselina 4 chlorindolyloctová, kyseliny fenyloctová a indolylbutyloctová. K syntetickým auxínom patria kyselina [3indolyl-i-maslová /IBA/, a-naftyloctová /NAA/ a 2,4-dichlórfenoxyoctová /2,4-D/.
Cytokiníny sú rastové regulátory, ktoré podporujú delenie buniek.Regulujú rast a vývin.Stimulujú zakladanie púčikov, spomaľujú proces stárnutia a odd'aľujú nástup dormancie .V pletivových kultúrach zvyšujú mitotickú aktivitu.
Medzi prirodzené cytokiníny patrí zeatín, ktorý bol prvý krát izolovaný z nezrelého zrna kukurice.Najčastejšie experimentálne používané syntetické cytokiníny sú kinetin a 6 benzylaminopurin (Gajdošová 1995).
Médium pre indukciu výhonkov by malo mat' relatívne nízky obsah auxínov a vysoký obsah cytokinínov.
Médium pre indukciu koreňov by malo mat' vysoký obsah auxínov a nízky obsah cytokinínov. Médium pre indukciu kalusu by malo mat' vyrovnanú hladinu auxínov a cytokinínov.

Napriek platnosti určitých všeobecných princípov v kultivácii a regenerácii rastlinných pletív, treba konštatovat', že neexistuje všeobecne použiteľné kultivačné médium, ale naopak, optimálne podmienky kultivácie pre jednotlivé rastlinné druhy, kultivary a dokonca jednotlivé genotypy je potrebné zistit' experimentálne.
Kultúry pletív z dospelých jedincov sú všeobecne menej citlivé a menej reagujúce v podmienkach in vitro ako kultúry pletív z mladých jedincov.
Klonálne množenie in vitro môže byt' dosiahnuté viacerými prístupmi:
- indukciou vývinu výhonkov z terminálnych a axilárnych púčikov
-produkciou a vývinom adventívnych púčikov a výhonlcov
- somatickou embryogenézou
- regeneráciou z izolovaných protoplastov
Regenerácia rastlín indukciou vývinu výhonkov z terminálnych a axilárnych púčikov má mnohé výhody. Púčiky obsahujú existujúce meristematické listové primordia, ktoré sú obalené vonkajšími šupinami, čo ul'ahčuje sterilizáciu materiálu.
Obsahujú tiež endogénne cytokiníny, ktoré sú potrebné na uskutočnenie morfogénnej reakcie.

Mikropropagácia pomocou priamej indukcie a vývinu adventívnych púčikov a výhonov je proces, ktorý pozostáva zo 4 presne definovaných štádií:
1. Indukcia adventívnych púčikov na explantáte na médiu s vysokým obsahom cytokinínu a nízkym obsahom auxínu.
2. Vývin výhonkov na médiu bez rastových regulátorov a následná multiplikácia výhonkov na médiu s vysokým obsahom cytokinínu a nízkym obsahom auxínu.
3. Zakoreňovanie nových výhonkov na médiu s vysokým obsahom auxínu.
4.Otužovanie rastlín - prenos rastlín z in vitro podmienok do in vivo podmienok.
Mikrorozmnožovanie pomocou nepriamej indukcie adventívnych púčikov /indulccia z kalusu/ je menej používanou technikou.
Najviac študovaným spôsobom mikrorozmnožovania v posledných rokoch je somatická embryogenéza, t.j. schopnost' tvorit' bipolárne štruktúry podobné embryám na povrchu explantátu /priama embryogenéza/ , alebo kalusu /nepriama embryogenéza/.
Schopnost' indukcie somatickej embryogenézy je silne geneticky kontrolovaná.Výhody somatickej embryogenézy sú v tom, že umožňuje produkciu vel'kého počtu rastlín, umožňuje vyhnút' sa problémom so zakoreňovaním výhonkov a skracuje čas potrebný pre získanie kompletnej rastliny.
Kultúry izolovaných protoplastov sa používajú pre produkciu somatických hybridov medzi rastlinnými druhmi, ktoré sú sexuálne inkompatibilné, alebo sú ťažko krížiteľné. Protoplasty sú zároveň vhodným nástrojom pre aplikáciu metód génového inžinierstva (Gajdošová 1995).

1.3.3. Indukcia kalusu

Kalus predstavuje súbor nediferencovaných buniek, ktoré sa pri vhodných kultivačných podmienkach neobmedzene dlho delia.Po zmene podmienok možno vyvolat' opätovnú diferenciáciu a získať celú rastlinu (Gajdošová 1995).
Rast kalusu je indukovaný umiestnením explantátu na médium a relatívne vysokou koncentráciou auxínu v prítomnosti nižšej koncentrácie cytokinínu, alebo bez neho. Odvodený kalus môže byt' d'alej kultivovaný na pevnom médiu alebo môže byt' použitý k odvodeniu suspenznej kultúry.
Vytvorený kalus je prenesený na médium s nižšou koncentráciou auxínu, kde dochádza k vytvoreniu orgánových základov. Často musí nasledovat' tretia fáza-zakoreňovanie (Dušková, Dušek 1997).
Kalusové pletivo prevedené z primárneho explantátu do pasážnej kultúry si môže neobmedzene dlho udržať svoju rastovú aktivitu, nie však všetky svoje východzie vlastnosti. Kultivačné podmienky pôsobia na populáciu kalusových buniek selekčným tlakom. Zvýhodňuje tie bunky, ktorým najlepšie vyhovuje a tie pomerne rýchlo v kultúre prevládnu.

Značná variabilita sa prejavuje v objeme buniek, v stupni ich vakuolizácie, v charaktere bunkovej steny a v karyologických znakoch.
Ďalšou zmenou v kultúre môže byt' strata jej morfogénnej schopnosti. Najskôr obvykle mizne schopnost' tvorit' pupene. Strata organogenetickej a embryogenetickej schopnosti bola pozorovaná pri mnohých kultúrach (Luštinec 1983).
Indukovat' kalusovú kultúru možno prakticky z každého druhu pletiva z dvojklíčnolistových rastlín. Primokultúra sa obyčajne kultivuje s prídavkom auxínov, hlavne tzv. tvrdších auxínov 2,4-D a NAA.
Kalusy podl'a zdroja primokultúry, druhu kultivačného média sa môžu líšit' vzhl'adom, kvalitou a farbou (Preťová 1995).

1.4. Faktory ovplyvňujúce regeneráciu v in vitro podmienkach

Z vonkajších faktorov, ktoré vplývajú na rast rastlín v in vitro, sú dôležité chemické a fyzikálne vlastnosti kultivačného média. Kultivačné médium má poskytnúť vo vhodnej forme zdroj uhlíka, dusíka, makroelementy, mikroelementy a stimulačné látky.
Má mat' optimálnu hodnotu osmotického potenciálu a pH, definovaný obsah a zloženie plynnej fázy v kultivačnej nádobe (Preťová 1995).

1.4.1.Kultivačné médiá

Kultivačné médium pozostáva z rôznych solí, makro a mikroelementov, z organických látok /vitamínov a rastových látok, cukrov, aminokyselín/
Do tzv.pevných médií sa obyčajne pridáva agar, fytogel atd'. Pestované kultúry potrebujú nevyhnutný prísun anorganických zložiek média. Tie, ktoré sú potrebné v relatívne väčšom množstve sa nazývajú makroelementy. Anorganické látky, ktoré sú potrebné v malých množstvách, sa nazývajú mikroelementy. Sem patria med', zinok, bór, železo a molybdén. Niekedy aj kobalt a jód.
Z týchto solí sa pripravujú tzv. zásobné roztoky a z nich sa aplikuje do média príslušné množstvo. Železo sa pridáva v chelátovej forme kvôli rozpustnosti. Okrem toho aj agar používaný na spevňovanie médií obsahuje niektoré mikroelementy.
Vitamíny sa do médií pridávajú iba v malých množstvách. Mnohí autori považujú

vitamín B 1 za esenciálny vitamín. Kyselina nikotínová /niacin/ a pyridoxin /B6/ stimulujú rast. Thiamín je nevyhnutný, ak sú cytokiníny v médiu v nízkej koncentrácii.Vitamíny sú obyčajne termolabilné, a preto je potrebné pridávat' ich do médií cez filter. Aminokyseliny sa obyčajne do kultivačných médií nepridávajú s výnimkou glycínu, ktorý je zložkou väčšiny kultivačných médií. Ak je potrebné pridat' do kultivačných médií dusík v organickej podobe, médium je možné obohatit' o kazein hydrolyzát, alebo kasaminovú kyselinu. Kazein hydrolyzát predstavuje zmes asi 18 aminokyselín.
Všetky pletivové kultúry vyžadujú prítomnosť cukrov pre zdravý rast. Cukry sú zdrojom energie pre rastlinné pletivá a aj zdxojom uhlíka. Skoro všetky rastlinné pletivá dobre reagujú na pridanie sacharózy. Sacharóza zároveň splňa úlohu osmotika. Osmotická hodnota médií ovplyvňuje aj regeneráciu a anatomickú stavbu regenerantov (Preťová 1974).
Pokial' sa nepracuje s tekutým médiom, používajú sa polotuhé alebo tuhé média. Väčšina stacionárnych kultúr sa pestuje na agarovom médiu. Agar sa používa v koncentrácii 0,6-1,0%. Okrem agaru sa používa aj agaróza a fytogel.
Výber kultivačného média závisí od typu rastlinného pletiva a od rastlinného druhu (Dedičová 1995).

1.4.2. Fyzikálne faktory sprevádzajúce pestovanie in vitro

Z vonkajších faktorov, ktoré vplývajú na rast kultúr v in vitro podmienkach, ide najmä o fyzikálne faktory akými sú teplota, hustota ožiarenia počas kultivácie a kvalita svetla.
Z fyzikálnych vlastností kultivačného média sú dôležité hlavne osmotická hodnota prostredia, kyslosť média, obsah a zloženie plynnej fázy v kultivačnej nádobe (Preťová 1995).
Hodnota pH má v biológii mimoriadny význam. Mnohé životné procesy ako napríklad enzymatické reakcie, príjem živín rastlinami prebiehajú iba pri určitom pH. Pod pojmom pH rozumieme koncentráciu voľných vodíkových iónov, ktorá určuje kyslost' alebo zásaditosť roztoku. Hodnoty pH sa pohybujú od 1 do 14, pričom hodnota pH=1 predstavuje veľmi kyslý roztok, pH=7 je hodnota neutrálneho roztoku a pH=14 je veľmi zásaditý roztok. Hodnoty pH meriame pH-metrom.
Dnes je k dispozícii celá škála týchto prístrojov.Pre prácu s nimi platí jedna všeobecná zásada , pred vlastným meraním prístroj treba nastaviť - kalibrovať pomocou štandartných roztokov.

Všetky typy pletivových kultúr s ohľadom na rastlinný druh, pôvod kultúry /orgánové,
protoplastové, bunkové/, ako aj typ kultúry /suspenzné, statické/ majú svoje špecifické nároky na kultivačné podmienky. Pri úspešnej kultivácii mnohých pletivových kultúr často býva limitujúcim faktorom vhodný svetelný a tepelný režim v kultivačnej miestnosti.
Ideálny spôsob kultivácie je použitie fytotrónu - kultivačnej komory s presne kontrolovateľnými a nastaviteľnými parametrami vhodnými pre kultiváciu príslušného rastlinného druhu (Dedičová 1995).
1.5. Význam primárnych explantátov

Mikropropagácia predstavuje spôsob vegetatívneho množenia rastlín pomocou pletivových kultúr.Oproti tradičným spôsobom vegetatívneho množenia má rad výhod:
1.Kultúra sa odvodí z vel'mi malých častí rastlín /explantátov/, z ktorých regenerujú malé rastliny.Minimalizáciou východzieho rezu až na rozmer jednej bunky sa nesmierne zvýšil množitel'ský koeficient, t.j. počet nových jedincov, ktorý je možné za určité obdobie získat' z jedinca pôvodného.K produkcii vel'kého počtu rastlín je potrebné málo priestoru, napr, pre rhododendron je uvádzaná možnosť produkovať 75 000 rastlín z metra štvorcového kultivačnej plochy za rok.
2. Rozmnožovanie prebieha v sterilných podmienkach. Ked' je kultúra in vitro odvodená, nedochádza k úhynu rastlín vplyvom ochorenia a odvodené rastliny sú bez bakteriálnych a hubových nákaz.
3. Je možná produkcia bezvírusových rastlín, a to pokial' je k založeniu kultúry použitý bezvirózny materiál. Úpravou podmienok možno tiež eliminovať vírové častice prítomné v explantáte.
4. Podmienky množenia sú presne definované. Faktory ovplyvňujúce rozmnožovanie je možné presne regulovat' za účelom zvýšenia koeficientu množenia. Rýchlost' mikropropagácie je ovel'a vyššia než u metód tradičných. Priememá teoretická výt'ažnost' meristémových kultúr je 106 rastlín za rok.
5. Je možné produkovať druhy rastlín, ktoré sa tradičnými metódami vegetatívneho množenia množia pomaly alebo sa nemnožia vôbec.
6. Rastliny možno množit' po celý rok bez závislosti na ročnom období.
7. Vzhl'adom k malým rozmerom východzieho rastlinného materiálu nie sú nároky na vel'ké skleníkové plochy pre uchovávanie matečných rastlín.
8. Rastliny in vitro medzi pasážami nevyžadujú v podstate žiadnu starostlivost' /napr. zálievku, pletie, chemické ošetrovanie a pod./ (Dušková, Dušek 1997).

1.5.1. Klíčenie rastlín v aseptických podmienkach

Sterilizácia je proces, pri ktorom dochádza k usmrteniu všetkých živých mikroorganizmov a ich zárodkov na rozličných predmetoch a materiáloch.
Pri aseptickej práci s rastlinnými kultúrami in vitro sa vyžaduje sterilizácia všetkých roztokov, kultivačných médií ako aj pomôcok, s ktorými rastlinný materiál príde do styku. Sterilizovať môžeme chemicky a fyzikálne. Spôsob sterilizácie volíme podl'a charakteru
materiálu, ktorý má byť sterilizovaný.
Sterilizovat' môžeme ultrafialovým žiarením, suchým horúcim vzduchom, vodnou parou za obyčajného alebo zvýšeného tlaku, plameňom, alebo špeciálnymi filtrami (Dedíčová 1995).
Charakteristickým a špecifickým menovatel'om práce v laboratóriu pletivových kultúr je stopercentná požiadavka na aseptické prostredie. Pri manipulácii s rastlinnými kultúrami in vitro, všetko čo prichádza s nimi do styku musí byť vhodným spôsobom vysterilizované.
Samotný rastlinný materiál použitý na založenie pletivovej kultúry musí byť dôkladne,
ale zároveň šetrne vysterilizovaný a potom je vhodný na d'alšie kultivovanie.