Biotechnológie, toto slovo biotechnológie je zložené z dvoch termínov : bio-život a technológia – náuka o technických veciach.
Biotechnológia je aplikácia vedeckých a inžinierskych princípov pre produkciu rôznych organických alebo anorganických látok pomocou biologických činiteľov, ktoré látky vytvoria,alebo pri ich tvorbe pomáhajú; biologický činiteľ zahrňuje aj biologickú katalýzu, príslušné mikroorganizmy, enzýmy, ako aj živočíšne a rastlinné bunky, alebo ich aktívne štruktúry.

Technológia in vitro kultúr
Základom rastlinného organizmu vznikajúceho pohlavným rozmnožovaním je jedna bunka – zygota, ktorá vznikne oplodnením vajcovej bunky spermatickou bunkou. Zygota je totipotentná a mitoticky sa delí. Na určitom stupni vývinu embrya sa bunky diferencujú a rozdelia si špecializované funkcie. Vzájomným pôsobením dedičných vlastností s vonkajšími podmienkami sa rastlina vyvíja, pričom sa diferencuje za vzniku špecifických štruktúr-pletív a jednotlivých rastlinných orgánov.
Diferenciáciou rozumieme získanie rozdielností ako v štruktúre tak aj vo funkcii buniek, ktorá je daná rozdielnou expresiou génov.
Prvými prejavmi diferenciácie je predlžovanie bunky a nerovnomerné bunkové delenie. Počas vývinu majú dôležitú úlohu v celom rastlinnom organizme korelácie medzi orgánmi a pletivami. Schopnosť rastliny regenerovať a vegetatívne sa rozmnožovať poukazuje na to, že jednotlivé časti sa vyznačujú veľkou autonómnosťou. Táto autonómnosť sa zakladá na totipotencii somatickej rastlinnej bunky. Pri rastlinnom organizme sa vychádza z toho, že nielen zygota je totipotentná, ale že totipotentná je ktorákoľvek živá rastlinná bunka. to znamená, že aj vysoko diferencovaná bunka obsahuje kompletnú genetickú informáciu a je schopná regenerovať mnohobunkovosť, štruktúru, sexualitu a fenotyp organizmu, z ktorého pochádza. Diferencované špecializované rastlinné bunky vykonávajú určité funkcie.
Zmenou podmienok, napríklad izoláciou špecializovaných buniek z rastliny a prenesením do vhodného média, môže nastať ich dediferenciácia a utvorí sa neorganizované kalusové pletivo.
Veľa cenných informácií o procese diferenciácie buniek bolo získaných na základe uplatnenia metódy kultivácie rastlinných buniek a pletív in vitro.
Metóda in vitro kultivácie umožňuje rast izolovaných častí rastliny-explantátov v definovaných kultivačných médiách v sterilnom prostredí a za regulovaných fyzikálnych podmienok /teplota a svetelný režim/.

1 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ
PROBLEMATIKY

1.1 Súčasnosť a budúcnosť biotechnologických metód

Dnes už je mnoho dôkazov, že pletivové kultúry predstavujú najrýchlejší a najspoľahlivejší spôsob rozmnožovania rastlín. To, čo priťahuje pozornosť pestovateľov, je najmä rýchlosť akou je možné množiť rastlinný materiál v in vitro podmienkach. Nemenej zaujímavý je aj obrovský potenciál pletivových kultúr, ktoré sa využívajú na skvalitnenie rastlín. Dnes je už ťažké nájsť rastliny, ktoré by sa pestovatelia nepokúšali pestovať v in vitro podmienkach.
Za posledné desaťročie sa vytvorili zásadné podmienky na využívanie explantátových kultúr ako novej metódy množenia a šľachtenia rastlín. Tieto techniky sa doplnili aj o ďaľšie, ktoré umožňujú ozdravovanie rastlinného materiálu od patogénov.

Tieto techniky môžu byť využité na prípravu obrovského počtu rastlín pri zachovaní nezmeneného rastlinného genómu. Z toho vyplýva, že rastliny budú mať presne tie isté charakteristiky ako má výchozia rastlina. Na druhej strane je možné využitím týchto tecník a základných znalostí získať rozšírenie a vyššiu plasticitu raslinného genómu ( napr. vyššia tolerancia k ochoreniu, zasoleniu a pod. (PREŤOVÁ, 1995 )
Problematika pletivových kultúr sa dotýka jedného základného princípu žýivota rastlín – schopnosti ich častí za vhodných podmienok samostatne žiť, rásť a vyvýjať sa. Táto schopnosť izolovaných buniek, pletív a orgánov bola využitá k spracovaniu metód regulácie rastových a diferenciačných procesov in vitro, ktoré dnes nachádzajú praktické uplatnenie v aplikovanej genetike a biotechnológii.
V rastlinnej ríši sa aplikujú kalusové pletivové kultúry v prípadoch keď sa má získať fytomasa obsahujúca cenné substancie, najmä na výrobu liečiv, pričom výskyt, alebo rast takejto fytomasy je v prírodných podmienkach nepostačujúci /žen-šen/

Rozšírené sú aj meristémové kultúry, ktoré umožňujú získať a rozmnožovať úplne sterilné, vírusov, baktérií a húb zbavené rastlinné druhy, čo má význam v pestovaní kvetov /ruže, gerbery, ľalie, tulipány, tropické kvety, orchidey/, liečivých a aromatických rastlín, ale aj technických plodín.
Hoci technika meristémových kultivácií využíva aj stimulátory rastu, je nezávislá od selekčných postupov využívajúcich génové manipulácie na zvýšenie odolnosti rastlín proti škodcom a zmenu ich úžitkových vlastností či zvýšenie výťažnosti, ale obe metódy sa môžu prelínať.

V živočíšnej ríši sa aplikujú bunkové kultúry založené na hybridómovej metodike. Tá je založená na spojení schopnosti rakovinových buniek neobmedzene sa rozmnožovať vo vhodnom živnom prostredí a schopnosti zdravých buniek produkovať farmaceuticky účinné látky. Fúziou oboch buniek sa dá vytvoriť nová bunka, ktorá je schopná rozmnožovať sa v umelom prostredí a súčasne tvoriť želané látky. Takto orientovaná biotechnológia buniek patrí do skupiny výroby liečiv.
Kultivácia živočíšnych pletív je pre ich morfologickú diferenciáciu obtiažna, ale pokroky sa dosahujú hlavne v oblasti embryonálnych štruktúr.
Biotechnologické metódy v súčasnosti významne ovplyvňujú technologické postupy, pretože rozširujú a urýchľujú možnosti rozmnožovania, selekcie a šľachtenia rastlín a drevín. Termín biotechnológií nie je nový, široko sa používal už na začiatku nášho storočia.
Explantátové kultúry ako techniky in vitro nachádzajú uplatnenie v oblasti teoretického výskumu a zároveň sú niektoré postupy využívané i prakticky.

Murashige /1974/ predpokladal štyri oblasti využitia pletivových kultúr :
o-produkcia látok pre farmaceutický priemysel
o-zlepšenie genetických vlastností rastlín
o-ozdravovanie klonov a ochrana germa plazmy
o-rýchla multiplikácia druhov a odrody
V súčasnosti sa napĺňajú ďalšie, v tom čase netušené možnosti
-génové inžinierstvo
-komerčné využitie

Rastlinný explantát predstavuje izolovanú, životaschopnú časť rastlinného organizmu, ktorá sa pestuje v podmienkach in vitro. Pojem explantát pochádza z talianskeho „ex plantare“, čo znamená pestovať mimo. Mimo materského organizmu, in vitro = v skle
Rastlinné bunky sú za určitých podmienok schopné vytvoriť celú rastlinu z jednej ,alebo niekoľkých somatických buniek. Vytvorené regeneranty môžeme spätne využiť na odber explantátov a celý pokus rozmnožovania sa týmto opakuje. Táto schopnosť, ktorá vychádza z totipotencie buniek, tvorí základ pre praktické použitie rastlinných explantátov. Totipotencia je charakteristickou vlastnosťou každej somatickej bunky, pričom najvýraznejšia je v bunkách meristému.
o všeobecnosti platí, že rozmnožovanie rastlín metódami explantátových kultúr pozostáva zo série metodických postupov, výsledkom ktorých je regenerovaná rastlina. Na druhej strane je potrebné vedieť, že neexistuje všeobecné pravidlo, či univerzálny postup, ktorý by bolo možné prijať ako návod pre úspešnú mikropropagáciu. Využitie pletivových kultúr v šľachtení rastlín možno rozdeliť do dvoch principiálnych oblastí :

1.Techniky, umožňujúce krátkodobé, resp. Dlhodobé uchovávanie rastlín v kultúre in vitro bez významnejších zmien pre potreby vegetatívneho množenia
2.Techniky indukcie genetickej variability najčastejšie využívané ako krátkodobý medzistupeň konkrétnej šľachtiteľskej metódy

Techniky zachovávajúce pôvodný genotyp:
·meristémové kultúry
·embryokultúry
·klonovanie in vitro

Techniky zachovávajúce pôvodný geenotyp:
a; meristémové kultúry :meristém pre založenie kultúry in vitro definoval HOLLINGS /1965/ ako štruktúru, obsahujúcu vlastný apikálny meristém s 1-2 pármi listových primordií. Pre tento typ kultúry sa bežne používa označenie meristémová kultúra. Pre rast izolovaných meristémov sú vhodné najbežnejšie kultivačné médiá jako B5, MS / Murashige, Skoog,1967/ Na médiách bez pridania rastových regulátorov sa vyvýja z meristému jeden výhon. Veľký vplyv na vývin meristémov majú cytokiníny. Odstraňujú inhibičný účinok apikálneho vrcholu na axilárne púčiky a stimulujú ich rast, meristémová kultúra potom nadobúda charakter mnohonásobných výhonkov. Najpoužívanejší cytokinín je BAP/ 6-benzylaminopurín/, ktorý je najčastejšou zložkou kultivačných médií vo fáze novovytvárania buniek /proliferácia/
Nesmierne cenným výledkom meristémových kultúr je eliminácia výrusových ochorení. Platí všeobecná zásada : čím je menší explantát, tým je vyššia pravdepodobnosť získania zdravého jedinca. Produktom meristémovej kultúry je fenotypovo, homogénne a geneticky stabilné potomstvo.

b; embryokultúry : RAGHAVAN /1980/ rozdelil embryokultúry do dvoch kategórií:
1.Kultúra semenných embryí, při ktorej sa ako explantát používa plne vyvinutá bipolárna štruktúra, obsahujúca koreňový aj stonkový meristém
2.Kultúra proembryí, čo je kultivácia všetkých nezrelých zárodkov ešte pred vyvinutí kotyledonov.
Zásadný rozdiel spočíva v tom, že staršie embryá sú po vyvinutí klíčnych listov autotrofné, kým obyčajné proembryá sú heterotrofné. Tento fakt sa prejaví aj v kultúre. Staršie embryá majú nižšie nároky na zloženie kultivačného média. Plne vyvinuté embryá sú schopné klíčiť na veľmi jednoduchých médiách /minerálne soli a sacharóza/. Mladšie embryá vyžadujú vyššiu osmotickú hodnotu média, napr. Globulárne ľanové proembrya až 12% sacharózy.
Podľa PIERIKA /1987/ embryokultúry slúžia na :
·elimináciu absolútnej inhibície klíčenia
·skrátenie šľachtiteľského cyklu skrátením, či vylúčením obdobia dormancie
·prevencia aborcie embryí
·vegetatívne rozmnožovanie

c; klonovanie in vitro : roznačuje sa aj ako mikropropagácia.Rozmnožovanie in vitro prebieha:
a/ indukciou axilárnych meristémov pri kultivácií izolovaných vrcholov /meristémové kultúry/
b/ tvorbou adventívnych meristémov a púčikov pri kultivácií orgánov alebo ich častí
c/ diferenciáciou rastlín procesom organogenézy alebo somatickej embryogenézy v podmienkach kalusových a bunkových kultúr.
Klonovanie in vitro rozdelil MURASHIGE /1978,1979/ do štyroch fáz /2-5/, no neskôr sa ku nim pridala i ďalšia fáza /1/ často označovaná aj ako nultá :
1.zahŕňa prípravu východiskového materiálu v optimálnych pestovateľských podmienkach, s radou fytosanitárnych opatrení
2.izolácia explantátu a jeho zavedenie do kultúry in vitro .Jej úlohou je zabezpečiť nekontaminovaný rast a vývin explantátu
3.vlastné rozmnožovanie – hlavným zmyslom tejto fázy je docieliť masové rozmnoženie bez straty genetickej stability, výber pracovnej metódy sa prispôsobuje rastlinnému druhu a explantátu

4.ukončenie tvorby axilárnych výhonkov, ich predlžovanie a zakoreňovanie.
Zvýšená intenzita svetla ja príprava výhonkov a rastlín z predchádzajúcej fázy na prenos do pody. Obsahuje významným adaptačným faktorom pre prechod od heterotrofnej k autotrofnej výžive
5.prenos rastlín do nesterilných podmienok a ich dopestovanie v pôde

Techniky zvyšujúce genetickú variabilitu

Bunky trvalých pletív explantátu izolované z celistvej rastliny a prenesené na kultivačné médium sa po určitej adaptačnej fáze začnú deliť. Mitotické delenie je obmedzené len na povrchové vrstvy buniek. Proces pri ktorom diferencované bunky trvalého pletiva prechádzajú do meristematického stavu sa považuje za dediferenciáciu. Výsledkom dediferenciácie in vitro je vytvorenie heterogénneho systému, ktorý má schopnosť spätnej diferenciácie na organizovanú štruktúru.
Kalusové pletivo, bunková kultúra i protoplastová kultúra je vlastne neorganizovaná explantátová kultúra. Je to nerovnorodý systém zložený z buniek rôzneho stupňa diferenciácie, s rozličnou morfogenetickou kompetenciou a rôznou reakciou na vonkajší morfogenetický signál /BEŽO,1995/
Medzi techniky rozširujúce genetickú variabilitu patria :
a; kalusové kultúry: kalus možno indukovať z každého druhu pletiva rastliny. Primokultúra sa najčastejšie kultivuje na médiu s prídavkom auxínov, alebo cytokinínov. V ďalších pasážach sa používa to isté médium ale zo zníženou koncentráciou fytohormónov. Kalusy sa podľa zdroja primokultúry, druhu kultivačného média sa môžu líšiť vzhľadom, kvalitou a farbou.
Kalus – pletivo, ktoré rastie neorganizovane bez zreteľnej polarity a usporiadania existujúceho vo vyvinutej rastline, ale dochádza k diferenciácií buniek
b; bunkové /suspenzné/ kultúry: zakladajú sa z tzv. rozpadavých kalusov, prenesených do tekutého kultivačného média
c; protoplastové kultúry: protoplasty sa získavajú z rôznych typov pletív rastlín a kultúr ich vystavením pôsobeniu celulytických a pektolytických enzýmov.Každý kultivovaný protoplast vytvorí po odstránení enzýmov bunkovú stenu. Bunky sa začnú deliť, každý protoplast vytvorí kolóniu intaktných buniek, z ktorých vznikne embryoid alebo mikrokalus a neskôr kalus