Elektromigračnými či elektroforetickými metódami nazývame súbor techník, ktoré využívajú pohyb ionizovaných častíc v elektrickom poli. Ak sú látky nesúce náboj rozpustené v elektrolyte, a sú umiestnené v elektrickom poli, začnú sa pohybovať konštantnou rýchlosťou úmernou veľkosti ich nábojov, anióny k anóde a katióny ku katóde. Rýchlosť, ktorou sa ión v elektrickom poli pohybuje, môže byť vyjadrená vzťahom:
v = u . E
v – rýchlosť iónu
u - elektroforetická pohyblivosť
E – intenzita elektrického poľa
Častice sú pri prechode okolitým médiom vystavené odporu síl vnútorného trenia. Ich mobilita je vtedy výsledkom rovnováhy medzi silou pôsobiacou na ióny v elektrickom poli a silou vnútorného trenia.
Snaha o dosiahnutie čo najlepšej separácie viedla k vypracovaniu veľkého množstva rôznych techník a ich modifikácií, ktoré môžeme zhrnúť do štyroch základných skupín:
1. elektroforéza s pohyblivým rozhraním – voľná elektroforéza
2. elektroforéza na nosičoch – zónová elektroforéza
3. rovnovážna elektroforéza reprezentovaná izoelektrickou fokusáciou
4. kapilárna elektroforéza
Zónová elektroforéza.
Zónovú elektroforézu možno použiť na analytické i preparatívne účely. Prevádza sa na nosičoch, ktoré sú usporiadané do stĺpcov, alebo rozprestrené na ploche ( sklo, hliníkové fólie a pod. ). Pre analytické účely je v súčasnej dobe najbežnejšie plošné usporiadanie. Prvými použitými nosičmi boli chromatografický papier, acetát celulózy, škrob alebo celulóza.
V súčasnej dobe sa používajú predovšetkým gélové materiály, a to agarózový gél, škrobový gél, polyakrylamidový gél. Elektroforetické nosiče musia byť hydrofilné, nerozpustné vo vode a mali by mať čo najmenej adsorpčných schopností.
Pri použití gélových materiálov sa pri separácii látok so zmesou uplatňuje vedľa elektroforetickej pohyblivosti i efekt molekulového sita. Molekuly sú vo svojom pohybe obmedzované prítomným gélom a preto rýchlosť ich pohybu závisí od veľkosti pórov a gélu. Veľké molekuly sú spomaľované viac, než molekuly malé. Separácia prebieha vtedy na základe veľkosti náboja a súčasne i veľkosti molekuly.
V súčasnosti sa na separácii bielkovín ( prípadne polynukleotidov ) používa elektroforéza v polyakrylamidovom géle, na separáciu väčších fragmentov DNA elektroforéza v agorózovomgéle. Elektroforéza bielkovín v polyakrylamidovom géle v prítomnosti aniónového tenzidu dodecylsíranu sodného umožňuje ich delenie podľa molekulovej hmotnosti.
Elektroforéza v agarózovom géle.
Agaróza je prírodný polysacharid červených morských rias rodu Gelidium a tvorí súčasť agaru, z ktorého je možno izolovať. Chemicky sa jedná o pravidelný kopolymer 1,3 - - D –
Galaktopyranózy a 1,4 – 3,6 – anhydro - - galaktopyranózy, ktorého molekulová hmotnosť sa pohybuje v rozmedzí 10 - 10 . Jednotlivé polyméry vytvárajú pravidelné zväzky, spojené vodíkovými väzbami. Pri teplote varu vody sa tieto mostíky rozrušujú a agaróza prejde do roztoku. Pri ochladzovaní jednotlivé polyméry vlákna reasociujú a tvoria gél, pokým je koncentrácia agarózy vyššia ako 0,2 %. Samotný gél je tvorený asociátmi zväzku, spojenými rovnako vodíkovými mostíkmi. Priestor medzi asociátmi, čiže veľkosť pórov závisí na koncentrácii agarózy. Napr.: v 2 % agarózovom géle je priemer póru asi 100 mm. Pohyb molekúl v elektrockom poli je brzdený zrážkami s molekulami agarózy a veľkosti pórov v štruktúre gélu. Princíp molekulového sita sa pri bežne používaných koncentráciách agarózy neuplatňuje, čím je umožnené delenie i veľkých molekúl. I keď sa dá elektroforéza v agaróze použiť na delenie tak bielkovín, ako aj nukleových kyselín, jej rozlišovacia schopnosť pre molekuly bielkovín je nízka a preto sa na tento účel používa výnimočne (imunoelektroforéza).
Je to však metóda voľby pre separáciu nukleových kyselín.
Detekcia molekúl DNA je najčastejšie prevádzaná pomocou ethidiumbromidu, čo je interkalačné činidlo, schopné viazať sa pevne na DNA. Po väzbe dôjde k podstatnému zvýšeniu kvantového výťažku fluorescencie viazaného farbiva.
Zóny jednotlivých frakcií zmesi DNA sa zviditeľnia po ožiarení UV svetlom (transiluminátor) ako ružové pásy na svetloružovom pozadí.
Efektívnosť delenia DNA v závislosti na koncentráciiagarózy:
% agarózy v géle oblasť efektívneho delenia lineárnych molekúl DNA, kpb
0,3 60 – 5
0,6 20 – 1
0,7 10 – 0,8
0,9 7 – 0,5
1,2 6 – 0,4
1,5 4 – 0,2
2,0 3 – 0,1
Horizontálna elektroforéza DNA v agaróznomgéle.
Prístroje a zariadenia:
Aparatúra pre horizontálnu elektroforézu, nalievací stojan, mikrocentrifúga, mikropipety, vortex, UV – transiluminátor s fotoaparátom.
a) príprava agarózneho gélu
Roztoky:
Elektroforetický pufer Tris – acetát 40 mM s 2 mM EDTA vzorkový pufer – 0,25 % bromfetová modrá, 40 % sacharóza + DNA gél: 50 ml 0,8 % agarózy + 3 l roztoku ethidiumbromidu.
Postup:
Pripraví sa nalievacia forma tvaru vaničky. Do odmeraného objemu elektroforetického pufera sa pridá vypočítané množstvo ( sacharózy ) agarózy. Zmes sa zohreje vo vodnom kúpelialebo mikrovlnke, pokým sa agaróza nerozpustí. Roztok sa ochladí asi na 70 C a pridá sa ethidiumbromid zo zásobného vodného roztoku v koncentrácii 10 mg / ml a na konečnú koncentráciu 0,5 g / ml.
Roztok agarózy ochladený na teplotu cca 70 C sa naleje do formy a do nej sa vloží vzorkovací hrebienok tak, aby bol umiestnený zvisle, asi 1 cm od okraja a aby jeho spodná hrana bola asi 1 mm od dna formy – dno musí byť tvorené agarózou. Gél zhustne pri izbovej teplote asi za 30 – 45 minút. Potom sa vanička vyberie z formy a vloží sa do elektroforetického pufra, aby prevýšil gél asi o 1 mm.
b) príprava a aplikácia vzoriek
Vzorky DNA sa zmiešajú so vzorkovým pufrom tak, aby obsahovali výslednú koncentráciu 7 % sacharózy a nanesú sa do jamiek vzniknutých po odstránení nanášacieho hrebienka. Maximálne množstvo nanášacej vzorky závisí od množstva fragmentov a ich rozmerov. Minimálne možno detekovať 2 ng pri 0,5 cm šírke pásu. Viac než 200 ng DNA môže spôsobovať prekrývanie pásu a rozmývanie. Pri analýze zmesi sa nanáša 200 – 500 ng v prípade málopočetných zmesí, v prípade pestrých zmesí stačí 5 – 10 ng.
DNA putuje k anóde, pričom najlepšia separácia sa dá dosiahnuť pri napätí cca 5 V / cm. Keď je gélredší ako 0,05 %, je lepšie pracovať v chlade.
c) vizualizácia DNA v UV svetle pomocou transiluminátora
Vizualizácia sa uskutočňuje v natívnomgéle hneď po skončeníelektroforézy. Vanička s gélom sa umiestni do zorného poľa UV – transiluminátora. Po ožiarení sa pásy rozdelenej DNA javia ako intenzívne ružové fluoreskujúce prúžky na svetlom ružovom pozadí. Gél možno priamo fotografovať použitím fotoaparátu s UV filtrom.
