a) antibiotikum sa netransportuje (rezistencia enterobaktérií na aminoglykozidy);
b) antibiotikum má zhoršený transport (rezistencia pseudomonád na chloramfenikol), alebo
c) vonkajšia membrána sa neenergizuje (rezistencia anaeróbnych baktérii na aminoglykozidy).

Aktívne vyčerpávanie z bunky. Rezistencia na antibiotiká môže byť vyvolaná schopnosťou baktérií aktívne vyčerpať z bunky antibiotikum (aktívny eflux). Príkladom takejto rezistencie je rezistencia S. epidermidis a príslušníkov rodu Proteus na chinolóny.
Inaktivácia vplyvom enzýmov. Najčastejším príkladom vzniku rezistencie je inaktivácia antibiotika vplyvom bakteriálnych enzýmov. Najčastejšími enzýmami sú b-laktamázy, enzýmy ktoré štiepia beta-laktámový kruh penicilínov a cefalosporínov. Produkujú ich gram- aj gram+ paličky, koky, anaeróbne baktérie aj mykobaktérie. Gény ktoré determinujú ich produkciu sú uložené na chromozómoch ale aj na plazmidoch, práve vďaka plazmidom sa v populácii baktérií ich výskyt zvýšil. S rastúcim používaním cefalosporínov sa začali objavovať nové laktamázy s rozšíreným spektrom označované ako ESBL (b-laktamázy s rozšíreným spektrom účinku).


Metódy zisťovania citlivosti baktérií na antibakteriálne chemoterapeutiká.

Cieľom in vitro zisťovania citlivosti baktérií na antibakteriálne chemoterapeutiká je získať informáciu o tom, či je mikrób citlivý, prípadne do akej miery, pre správnu a optimálnu voľbu preparátu na liečbu, aby sa dosiahol cielený antibakakteriálny účinok pri minimálnych vedľajších účinkoch. Metódy zisťovania citlivosti sa delia na kvalitatívne a kvantitatívne.

Kvalitatívna metóda je disková, difúzna metóda používajúca jednu koncentráciu antibiotika. Výsledok indikuje, či je kmeň citlivý (S), rezistentný (R), alebo intermediárne (stredne) citlivý (I). Diskový test musí byť štandardizovaný, pretože jeho výsledok môže ovplyvniť mnoho faktorov. Používa sa štandardná pôdu Mueller-Hintonovej (MH), výška naliatej pôdy v Petriho miske musí byť 4 mm, štandardné inokulum baktérií (hustota suspenzie baktérií vo fyziologickom roztoku) 1-3 x 108/ml, čo zodpovedá 0,5 – 1 stupňom Mc Farlandovej zákalovej stupnice. Zdrojom antibakteriálnych chemoterapeutík sú disky - krúžky filtračného papiera o priemere 6 mm, ktoré obsahujú štandardné množstvo testovanej látky. Koncentrácia v disku zodpovedá 1/3-1/4 sérových hladín dosahovaných pri štandardnej liečbe. Po naočkovaní baktérií na kultivačnú pôdu a po pridaní diskov (maximum 6 diskov na jednu Petriho misku) nasleduje inkubácia v termostate pri teplote 35 - 37 0C po dobu 18- 24 hodín. Po inkubácii sa merajú priemery inhibičných zón rastu baktérií v mm. Priemer inhibičných zón je priamo závislý na citlivosti testovaného kmeňa a obsahu látky v disku. Nepriamo závisí od výšky agarovej vrstvy a hustoty inokula. Pre jednotlivé antibakteriálne chemoterapeutiká a testované baktérie sú stanovené hraničné veľkosti inhibičných zón v mm nazývané „break-pointy“. Zistené veľkosti inhibičných zón sa interpretujú podľa príslušných hodnôt break-pointov. Ako citlivý sa označuje kmeň so zónou rovnakou alebo väčšou, za rezistentný kmeň so zónou menšou ako má štandardný kmeň pre rovnaký druh baktérií.

Kvantitatívne metódy (dilučné). Dilučné metódy umožňujú zistiť najmenšiu koncentráciu antibakteriálneho chemoterapeutika, ktorá vyjadruje mieru citlivosti mikroorganizmu. Stanovuje sa minimálna inhibičná koncentrácia (MIC), čo je najnižšia koncentrácia, ktorá zastaví rast baktérií a minimálna baktericídna koncentrácia (MBC), čo je najnižšia koncentrácia, ktorá usmrtí 99,9 % príslušníkov populácie vyšetrovaných baktérií. Hodnoty MIC a MBC sa udávajú v mg/l. Princípom dilučných metód je použitie jednotlivých riedení testovaného antibiotika na štandardné množstvo bakteriálneho kmeňa (inokulum) v agare alebo v tekutom médiu. Je niekoľko metód pre stanovenie MIC, výber metódy závisí od účelu vyšetrovania.

Štandardnou je agarová metóda, kde sa do Petriho misiek nalieva kultivačná pôd obsahujúca rôzne koncentrácie antibiotika. Na jednu misku sa naočkuje 30 rôznych kmeňov. Po inkubácii sa hodnotí rast baktérii pri rôznych koncentráciách. MIC je najnižšia koncentrácia, pri ktorej testovaný kmeň nevyrastie. V tekutom médiu sa stanovuje MIC v skúmavkách alebo v mikroplatničkách, ktoré obsahujú rôzne koncentrácie antibiotík. Rast baktérií sa hodnotí podľa zákalu (ak je mikrób citlivý, kultivačné médium sa nezakalí, ak je mikrób rezistentný, médium sa zakalí). Vizuálne odčítanie zákalu je málo presné, je treba používať fotometrické odčítanie, alebo zvýraznenie rastu pomocou farebných indikátorov (napríklad tetrazoliové soli). V praxi sa zaužívala kolorimetrická mikrometóda na paneloch, ktoré sa vyhodnocujú aj pomocou počítača. Niektoré prístroje majú zabudovaný expertný systém, ktorý priamo koriguje nekonzistentné alebo nepravdepodobné výsledky z hľadiska účinnosti in vivo a prirodzenej rezistencie, ktorá sa nemusí in vitro prejaviť.

MIC možno určovať aj pomocou rôznych automatizovaných mikrotitračných systémov. E - test je kvantitatívnou modifikáciou diskovej difúznej metódy. Robí pomocou kalibrovaných prúžkov obsahujúcich gradient koncentrácií antibiotika. Na prúžku je vyznačená stupnica s jednotlivými hodnotami MIC. Inhibičná zóna, ktorá sa vytvorí má tvar pretiahnutej kvapky, ktorá svojim ostrým koncom zasahuje práve do miesta, kde je koncentrácia antibiotika rovná MIC. Stanovenie MBC sa robí obdobným spôsobom ako stanovenie MIC v mikrotitračných platničkách alebo v skúmavkách. Po príslušnej inkubácii inokula s riedeným ATB sa odoberie presné množstvo (po 10 ml) obsahu jamiek alebo skúmaviek, v ktorých došlo k zábrane rastu (pôda sa nezakalila) a naočkuje sa na pevné kultivačné pôdy, každú jamku na osobitnú pôdu. Po inkubácii 18-24 hod pri teplote 37 0C sa odčíta počet vyrastených kolónií a prepočíta sa na celý objem príslušnej jamky.