referaty.sk – Všetko čo študent potrebuje
Rudolf
Sobota, 17. apríla 2021
Ako získať DNA
Dátum pridania: 02.07.2008 Oznámkuj: 12345
Autor referátu: m8
 
Jazyk: Slovenčina Počet slov: 1 602
Referát vhodný pre: Vysoká škola Počet A4: 4.8
Priemerná známka: 3.00 Rýchle čítanie: 8m 0s
Pomalé čítanie: 12m 0s
 
Vzájomné oddelenie jednotlivých druhov NK: nízkomolekulové druhy RNA ( 4S a 5S ) a DNA možno oddeliť od vysokomolekulových RNA 3 mol.dm -3 etátom draselným pri pH 6,0 za 3 hodiny pri 0°C. rRNA sa oddeľuje, kým 4S a 5S RNA a DNA zostávajú v roztoku. Prečistenie preparátov NK špeciálnymi postupmi: na oddelenie jednotlivých druhov NK a na ich prečistenie od rôznych interferujúcich prímesí sa využíva gélová filtrácia. Na izoláciu natívnych preparátov NK sa používa adsorbčná chromatografia na hydroxyapatite ktorá sa používa hlavne na oddelenie preparátov natívnej a denaturovanej DNA i na prípravu vysokočistej DNA z rôznych zdrojov.

Niektoré druhy NK možno kvalitne oddeliť i afinitnou chromatografiou pri ktorej, sa využívajú niektoré špecifické fyzikálno-chemické vlastnosti a štruktúrne charakteristiky NK. Ďalším špeciálnym postupom je frakcionácia NK ultracentrifugáciou a to v sacharózových gradientoch, kde sa oddeľujú NK na základe rozličnej rýchlosti ich sedimentácie v odstredivom prostredí hustotového gradientu a v gradientoch chloridu cézneho, čo je jedna z najšetrnejších metód izolácie, purifikácie a frakcionácie preparátov DNA. Oddeľujú sa tu populácie DNA, ktoré sa líšia svojou hustotou a relatívnou molekulovou hmotnosťou. Uplatňuje sa tu stúpajúca hustota molekúl DNA zo zvyšujúcim sa obsahom guanínových a cytidínových nukleotidov. Natívna jednovláknová DNA má vyššiu hustotu ako natívna dvojvláknová DNA. Touto metódou možno oddeliť i termálne denaturovanú DNA od preparátu dvojvláknovej natívne DNA. V hustotovom gradiente chloridu cézneho možno oddeliť chromozómovú DNA od extrachromozómovej DNA, ktorá má vyššiu hustotu. Izopyknickou centrifugáciou možno získať kvalitný preparát cirkulárnej DNA.

Metódy izolácie DNA

DNA sa uvoľní z pletiva spolu s RNA pri extrakcii pomocou p – aminosalicilátu, chloridu sodného, fenolkrezolovej zmesi a potom sa extrahuje 3 mol.dm -3 octanom sodným. DNA pripravená touto metódou je prakticky bez bielkovín a má sedimentačnú konštantu 16 až 18 S.

Chemikálie a roztoky :
A: 6 % vodný roztok sodnej soli p – aminosalicilátu
B: 1 % chlorid sodný
C: zmes fenolu a m – krezolu
500 g kryštalického fenolu predestilovaného
70 cm3 m – krezolu
55 cm3 vody
50 mg 8 hydroxychinolínu
D: chlorid sodný ( kryštalický )
E: zmes 95 % etanolu – m – krezolu ( pomer 9:1 )
F: 3 mol.dm-3 octan sodný, pH 6,0
G: 2 – etoxyetanol
H: 1 mol.dm-3 chlorid sodný
I: benzoan sodný v substancii
J: m- krezol
K:0,5 mol.dm-3 chlorid sodný v 0,3mol.dm-3 octane sodnom
L: 0,14 mol.dm-3 chlorid sodný v 0,015 mol.dm-3 citrane sodnom, pH 7,1


Pracovný postup:

1. Tkanivo sa zmrazí v kvapalnom dusíku, rozdrví sa na prášok a homogenizuje sa v trojnásobnom až štvornásobnom objeme roztokov A,B,C ( objemový pomer 1:1:1 )
2. Zmes sa mieša 20 minút pri teplote 20°C, potom sa centrifuguje 30min. pri 600 g pri 5°C
3. Vodná vrstva sa odsaje, pridá sa k nej kryštalický chlorid sodný ( 3 g na každých 100 cm3vodnejvrstvy )
4. Po rozpustení chloridu sodného sa k vodnej vrstve pridá polovičný objem roztoku C, zmes sa mieša 5 minút pri 20 oC a centrifuguje sa pri 8000 g 15 minút pri 5°C.
5. Odoberie sa vodná vrstva, zmieša sa z dvoma objemami zmesi E a nechá sa stáť 30 – 60 minút pri 2°C.
6. Vytvorený precipitát sa odcentrifuguje a ešte 2 krát sa premyje dávkami 25 cm3 roztoku F.
7. K spojeným supermatantom sa pridá rovnaký objem 2 – etoxyetanolu, precipitát sa odcentrifuguje a znovu sa rozpustí v roztoku H. Pridá sa benzoan sodný do výslednej koncentrácie 20 %, zmes sa dôkladne premieša a po rozpustení benzoanu sodného sa centrifuguje 90 minút pri 40 000 g pri 2°C.
8. K supernatantnej frakcii sa pridá m – krezol ( 1/5 objemu supernatantnej frakcie ). DNA sa oddelí vo forme relatívnej hmoty a odcentrifuguje sa.
9. Želatínový sediment sa rozpustí v roztoku K a vyzráža sa rovnakým objemom 2 – etoxyetanolu.
10. Vytvorené vlákna DNA sa rozpustia v roztoku K a dialyzujú sa pri 2°C oproti tomu istému roztoku.
11. Preparát DNA sa po dialýze uchováva rozpustený v roztoku K pri teplote – 30°C.
 
späť späť   1  |   2   
 
Copyright © 1999-2019 News and Media Holding, a.s.
Všetky práva vyhradené. Publikovanie alebo šírenie obsahu je zakázané bez predchádzajúceho súhlasu.