Ako získať DNA

Ako získať DNA

Na izoláciu DNA je dôležité dôkladné rozrušenie pletív buniek a ich súčastí. Možno povedať, že bunky vyšších organizmov deštruujú ľahšie a jednoduchšie, naopak rastlinné bunky a pletivá a bunky mikroorganizmov sú rezistentnejšie a ich rozbíjaním sa môžu niekedy poškodiť i štruktúry niektorých druhov nukleových kyselín. Bunky sa obvykle rozrušujú v prostredí príslušného extrakčného činidla, ktoré má overenú iónovú silu, reakciu prostredia obsahuje inhibítory nukleáz a pod. Neúplná deštrukcia analyzovanej vzorky tkaniva alebo buniek sa nemusí prejaviť len nižším výťažkom nukleových kyselín ale napr. v rastlinnom materiáli ľahšie uskutočniteľné rozrušenie mladších druhov buniek môže viesť k selektívnej extrakcii nukleových kyselín týchto mladších druhov buniek. Jedným z najviac používaných postupov deštrukcie rastlinných buniek a pletív je mechanické rozdrvenie materiálu, ktoré však niekedy môže zapríčiniť i čiastočnú degradáciu nukleových kyselín.

Výhodnejším môže byť , zmrazenie rastlinného materiálu v kvapalnom dusíku s nasledujúcim rozdrvením na prášok a extrakciou v mixéri alebo v sklenenom homogenizátore. Extrakt z mimoriadne ťažko deštruujúceho materiálu možno získať tak, že sa pletivo najprv odvodní v 95% etanole alebo etylénglykole a extrakt sa potom postupne premýva etanolom, etanolom – etyléterom v pomere 3:1, etanolom – etyléterom v pomere 1:1 bezvodným etyéterom a nakoniec sa dosuší v prúde dusíka.

Pri izolácii nukleových kyselín sa používajú extrakčné médiá, ktoré sa zvyčajne skladajú zo základného tlmivého roztoku ku ktorému sa pridávajú deproiteinačné činidlá, detergenty s hlavnou úlohou uvoľniť nukleové kyseliny z ich väzby na bielkoviny, inhibítory nukleóz a ďalšie špecifické zlúčeniny. Medzi inhibítory ribonukleóz a deoxyribonukleóz patrí etyléndiamíntetraacetát, bentonit, proteáza Streptomyces griseus, dietylpyrokarbonát, makaloid tj. záporne nabitý silikát, aniónové detergenty ako sodné a lítne soli laurylsíranu a deoxycholátu, ktoré sú silné inhibítory nukleáz a dietylaminoetyl – dextrán, ktorý chráni RNA a DNA pred pôsobením príslušných nukleáz.

Uvoľnenie väzby medzi nukleovou kyselinou a bielkovinou sa dá šetrne previesť pomocou viacerých zväčša aniónových detergentov pridaných do extrakčného média. Z najviac používaných sú to tieto detergenty : sodná alebo lítna soľ laurylsíranu , laurylsarkozinát sodný, deoxycholát sodný, naftalén – 1,5 – disulfonát sodný, toluén – p – sulfonát a p - aminosalicilát vo forme sodnej soli, ktorý pri fenolovej extrakcii umožňuje lepšie uvoľňovanie NK z bunkových štruktúr a z ich väzby na bielkovinovú zložku.

Dôkladné prečistenie preparátov NK od bielkovinových prímesí, sa dá uskutočniť viacerými postupmi, v ktorých použité činidlá denaturujú prítomné bielkoviny a NK zostávajú rozpustené vo vodnej fáze bez toho aby sa porušila ich štruktúra. Z deproteinizačných prostriedkov sa na izoláciu NK používajú najčastejšie : fenol, chloroform, guanidinchlorid, chloristan sodný. Preparáty NK pripravené základnými izolačnými postupmi obvykle nepredstavujú homogénne poulácie. Nejde tu len o zmesi jednotlivých druhov NK, ale často i o prímes iných interferujúcich látok, najmä polysacharidov a ďalších iných fosfátových esterov.


Oddelenie NK a polysacharidov možno urobiť pomocou cetyltrimetylamoniumbromidu (CTA). Pomocou neho možno oddeliť oba druhy NK, pričom polysacharidy a väčšina ďalších fosfátových esterov zostáva v roztoku. CTA – soli NK sa odcentrifugujú, opakovane sa premyjú 70% etanolom a etyléterom a nakoniec sa dosušia vo vákuu.

Prečistenie DNA od prímesí RNA sa môže robiť enzymaticky, izopropylalkoholom a fenolovou extrakciou. Enzymaticky sa DNA od RNA očisťuje pomocou špecifických ribonukleáz, ktoré degradujú RNA na oligoribonukleotidy. Deproteinovaný bunkový extrakt sa nechá inkubovať 30 minút pri 37°C v prítomnosti pankreatickej ribonukleázy z ktorej sa musia pred samotným použitím odstrániť stopy deoxyribonukleázy. 0,2 % roztok kryštalickej pankreatickej ribonukleázy v 0,15 mol.dm-3 roztoku chloridu sodného s pH 5,0 sa predinkubuje 10 minút pri 80°C. Preparát DNA sa po inkubácii s enzýmom precipituje etanolom, kým hydrolyticky uvoľnené oligoribonukleotidy zostávajú v roztoku.

Čistenie DNA izopropylalkoholom: DNA sa oddeľuje, kým RNA zostáva v roztoku. Fenolová extrakcia: DNA sa oddeľuje od RNA a to tým, že sa využíva závislosť uvoľnenia DNA od pH fenolového extrakčného roztoku. Zistilo sa, že ak pH fenolového roztoku je 6,0 do vodnej fázy prechádza len RNA, kým DNA je nerozpustná. Pri zvyšovaní pH prostredia, prechádza do roztoku i DNA a pri pH fenolového roztoku 7,4 možno DNA kompletne vyextrahovať do vodnej fázy extrakčného média.
Vzájomné oddelenie jednotlivých druhov NK: nízkomolekulové druhy RNA ( 4S a 5S ) a DNA možno oddeliť od vysokomolekulových RNA 3 mol.dm -3 etátom draselným pri pH 6,0 za 3 hodiny pri 0°C. rRNA sa oddeľuje, kým 4S a 5S RNA a DNA zostávajú v roztoku. Prečistenie preparátov NK špeciálnymi postupmi: na oddelenie jednotlivých druhov NK a na ich prečistenie od rôznych interferujúcich prímesí sa využíva gélová filtrácia. Na izoláciu natívnych preparátov NK sa používa adsorbčná chromatografia na hydroxyapatite ktorá sa používa hlavne na oddelenie preparátov natívnej a denaturovanej DNA i na prípravu vysokočistej DNA z rôznych zdrojov.

Niektoré druhy NK možno kvalitne oddeliť i afinitnou chromatografiou pri ktorej, sa využívajú niektoré špecifické fyzikálno-chemické vlastnosti a štruktúrne charakteristiky NK. Ďalším špeciálnym postupom je frakcionácia NK ultracentrifugáciou a to v sacharózových gradientoch, kde sa oddeľujú NK na základe rozličnej rýchlosti ich sedimentácie v odstredivom prostredí hustotového gradientu a v gradientoch chloridu cézneho, čo je jedna z najšetrnejších metód izolácie, purifikácie a frakcionácie preparátov DNA. Oddeľujú sa tu populácie DNA, ktoré sa líšia svojou hustotou a relatívnou molekulovou hmotnosťou. Uplatňuje sa tu stúpajúca hustota molekúl DNA zo zvyšujúcim sa obsahom guanínových a cytidínových nukleotidov. Natívna jednovláknová DNA má vyššiu hustotu ako natívna dvojvláknová DNA. Touto metódou možno oddeliť i termálne denaturovanú DNA od preparátu dvojvláknovej natívne DNA. V hustotovom gradiente chloridu cézneho možno oddeliť chromozómovú DNA od extrachromozómovej DNA, ktorá má vyššiu hustotu. Izopyknickou centrifugáciou možno získať kvalitný preparát cirkulárnej DNA.

Metódy izolácie DNA

DNA sa uvoľní z pletiva spolu s RNA pri extrakcii pomocou p – aminosalicilátu, chloridu sodného, fenolkrezolovej zmesi a potom sa extrahuje 3 mol.dm -3 octanom sodným. DNA pripravená touto metódou je prakticky bez bielkovín a má sedimentačnú konštantu 16 až 18 S.

Chemikálie a roztoky :
A: 6 % vodný roztok sodnej soli p – aminosalicilátu
B: 1 % chlorid sodný
C: zmes fenolu a m – krezolu
500 g kryštalického fenolu predestilovaného
70 cm3 m – krezolu
55 cm3 vody
50 mg 8 hydroxychinolínu
D: chlorid sodný ( kryštalický )
E: zmes 95 % etanolu – m – krezolu ( pomer 9:1 )
F: 3 mol.dm-3 octan sodný, pH 6,0
G: 2 – etoxyetanol
H: 1 mol.dm-3 chlorid sodný
I: benzoan sodný v substancii
J: m- krezol
K:0,5 mol.dm-3 chlorid sodný v 0,3mol.dm-3 octane sodnom
L: 0,14 mol.dm-3 chlorid sodný v 0,015 mol.dm-3 citrane sodnom, pH 7,1


Pracovný postup:

1. Tkanivo sa zmrazí v kvapalnom dusíku, rozdrví sa na prášok a homogenizuje sa v trojnásobnom až štvornásobnom objeme roztokov A,B,C ( objemový pomer 1:1:1 )
2. Zmes sa mieša 20 minút pri teplote 20°C, potom sa centrifuguje 30min. pri 600 g pri 5°C
3. Vodná vrstva sa odsaje, pridá sa k nej kryštalický chlorid sodný ( 3 g na každých 100 cm3vodnejvrstvy )
4. Po rozpustení chloridu sodného sa k vodnej vrstve pridá polovičný objem roztoku C, zmes sa mieša 5 minút pri 20 oC a centrifuguje sa pri 8000 g 15 minút pri 5°C.
5. Odoberie sa vodná vrstva, zmieša sa z dvoma objemami zmesi E a nechá sa stáť 30 – 60 minút pri 2°C.
6. Vytvorený precipitát sa odcentrifuguje a ešte 2 krát sa premyje dávkami 25 cm3 roztoku F.
7. K spojeným supermatantom sa pridá rovnaký objem 2 – etoxyetanolu, precipitát sa odcentrifuguje a znovu sa rozpustí v roztoku H. Pridá sa benzoan sodný do výslednej koncentrácie 20 %, zmes sa dôkladne premieša a po rozpustení benzoanu sodného sa centrifuguje 90 minút pri 40 000 g pri 2°C.
8. K supernatantnej frakcii sa pridá m – krezol ( 1/5 objemu supernatantnej frakcie ). DNA sa oddelí vo forme relatívnej hmoty a odcentrifuguje sa.
9. Želatínový sediment sa rozpustí v roztoku K a vyzráža sa rovnakým objemom 2 – etoxyetanolu.
10. Vytvorené vlákna DNA sa rozpustia v roztoku K a dialyzujú sa pri 2°C oproti tomu istému roztoku.
11. Preparát DNA sa po dialýze uchováva rozpustený v roztoku K pri teplote – 30°C.