Western blotting

Úvod:
Analýza pomocou Westernovho prenosu dokáže nájsť jednu bielkovinu v množstve iných bielkovín, pričom určí aj dĺžku daného proteínu. Pri tejto analýze nie je dôležité, či boli bielkoviny syntetizované in vivo, alebo in vitro. Táto metóda je avšak závislá na použití veľmi kvalitných protilátok zameraných na vybranú bielkovinu. Takže musíme byť schopní vyprodukovať aspoň malú dávku bielkoviny z vysyntetizovaného DNA fragmentu. Použijeme protilátku ako sondu na nájdenie bielkoviny, ktorá nás zaujíma.
Western blotting nám hovorí koľko z danej bielkoviny sa uložilo v bunkách.

Mechanizmus metódy:

1) Separácia proteínov použitím SDS-polyacryamidovej gélovej elektroforézy, ktorá separuje bielkoviny podľa veľkosti.

2) Položíme nitrocelulózovú membránu na gél a použitím elektoforézy prenesieme bielkovinové (polypeptidové) pásy na membránu. Potrebujeme aby záporný náboj bol na gély a kladný na membráne, aby sme záporne nabité bielkoviny preniesli na kladne nabitú membránu. Týmto získame nitrocelulózovú membránu, ktorá obsahuje rovnaké bielkovinové pásy ako gél.
Bielkoviny sa lepšie viažu na nitrocelulózu pri nižšom pH, preto treba hľadať optimálnu hodnotu pH. Tak isto musíme dávať pozor aby neboli žiadne vzduchové bubliny medzi membránou a gélom, lebo sa bielkoviny nepremiestnia.

3) Inkubujeme nitrocelulózovú membránu primárnou protilátkou. Primárna protilátka sa naviaže na našu bielkovinu a vytvorí komplex protilátka-bielkovina s bielkovinou, ktorá nás zaujíma.

4) Inkubujeme nitrocelulózovú membránu sekundárnou protilátkou. Táto protilátka by mala byť komlpex protilátka-enzým. Sekundárna protilátka by mala byť protilátka proti primárnej. To znamená, že sekundárna protilátka sa naviaže na primárnu tak ako sa primárna protilátka naviazala na bielkovinu. Enzým je tu na to, aby nám to všetko umožnil vizualizovať. Je to akokeby molekulárna svetlica zachytená na protilátkach, ktorá nám ukazuje čo sa deje.

5) Na to, aby sme videli náš enzým v činnosti, potrebujeme ho inkubovať v súbore reakcii, ktoré sú špecifické pre daný enzým. Ak sme všetko spravili správne, budeme vidieť pásy kdekoľvek je komplex bielkovina -primárna protilátka - sekundárna protilátka -enzým, alebo inými slovami tam, kde je naša hľadaná bielkovina.

6) Položíme RTG film na gél aby sme našli žiarenie, ktoré vychádza z enzýmu. Reakcia väčšinou vyprchá za hodinu.

III. Northern blotting

Úvod:
Northernov prenos nám umožňuje zistiť prítomnosť, neprítomnosť a relatívne množstvo špecifických RNA sekvencií, ktoré nás zaujímajú.