Blotting (prenos)

I. Southern blotting (Metóda polymorfizmu dĺžky restrikčných fragmentov – RFLP)

Úvod:
Southern blotting bol pomenovaný podľa Edwarda M. Southerna, ktorý vyvinul tuto metódu v Edinburghskej Univerzite v roku 1970. V tejto metóde sa molekuly DNA prenášajú z agarózového gélu na membránu. Southernov prenos je vyvinutý na nájdenie časti sekvencie DNA. Napríklad Southernov prenos môže byť použitý na nájdenie konkrétneho génu v celom genóme.
Množstvo DNA potrebnej na túto techniku závisí na veľkosti a špecifickej aktivite sondy. Mechanizmus metódy:

1) Naštiepenie DNA príslušným restrikčným enzýmom, čím získame DNA úseky zakončené rovnakými sekvenciami.

2) Nanesenie štiepenej DNA na agarózový gél.

3) Denaturácia DNA:
Celý roztok sa vloží do zásaditého roztoku(pH = 12), čím sa porušia vodíkové väzby a oddelia sa.

4) Neutralizácia:
Gél sa vloží do neutralizačného roztoku, čím sa zamedzí opätovnému spárovaniu DNA.

5) Prenos denaturovanej DNA na membránu:
Zvyčajne sa používa nitrocelulózová, nylonová alebo pozitívne nabitá nylonová membrána. Nitrocelulózová má schopnosť naviazať okolo 100μg/cm, pričom nylonová môže naviazať až 500μg/cm. Väčšinou sa používa nylonová membrána, keďže má väčšiu kapacitu a je menej krehká. Prenos prebieha pomocou kapilárnych javov, čo trvá niekoľko hodín. Tieto javy "ťahajú" roztok cez gél do membrány , ktorá zachytí rozštiepenú DNA.
Namiesto kapilárnej techniky môžeme použiť aj vákuovú. Pri tejto metóde vákuum "ťahá" SSC pufor cez membránu. Funguje podobne ako kapilárna metóda, ale viac SSC prejde cez gél a membránu, takže je rýchlejšia(trvá približne hodinu). (SSC zabezpečuje vysokú slanosť, ktorú potrebujeme na prenos DNA.)
Následne ožiarime membránu UV žiarením, čo preruší spojenia medzi DNA a membránou. Namiesto použitia UV svetla môžeme nitrocelulózovú membránu zapiecť pri teplote 80 stupňov C, pričom treba dávať pozor na vysokú horľavosť. 6) Hybridizácia:
V tomto kroku sa spája ľudská DNA a sonda(= 1 vláknový úsek, ktorého sekvenciu poznáme a zisťujeme či je alebo nie je prítomná v ľudskej DNA, prípadne koľkokrát sa tam takýto úsek nachádza).
Sondy môžu byť rádioaktívne(niektoré nukleotidy sú označené izotopom), alebo fluorescenčne(pomocou biotínu = bioxigenín) značené. Membrána, ktorá vyžaruje rádioaktivitu na určitých miestach sa dá do špeciálnej kazety s RTG filmom a nechá sa exponovať. Následne sa film vyvolá.

II.

Western blotting

Úvod:
Analýza pomocou Westernovho prenosu dokáže nájsť jednu bielkovinu v množstve iných bielkovín, pričom určí aj dĺžku daného proteínu. Pri tejto analýze nie je dôležité, či boli bielkoviny syntetizované in vivo, alebo in vitro. Táto metóda je avšak závislá na použití veľmi kvalitných protilátok zameraných na vybranú bielkovinu. Takže musíme byť schopní vyprodukovať aspoň malú dávku bielkoviny z vysyntetizovaného DNA fragmentu. Použijeme protilátku ako sondu na nájdenie bielkoviny, ktorá nás zaujíma.
Western blotting nám hovorí koľko z danej bielkoviny sa uložilo v bunkách.

Mechanizmus metódy:

1) Separácia proteínov použitím SDS-polyacryamidovej gélovej elektroforézy, ktorá separuje bielkoviny podľa veľkosti.

2) Položíme nitrocelulózovú membránu na gél a použitím elektoforézy prenesieme bielkovinové (polypeptidové) pásy na membránu. Potrebujeme aby záporný náboj bol na gély a kladný na membráne, aby sme záporne nabité bielkoviny preniesli na kladne nabitú membránu. Týmto získame nitrocelulózovú membránu, ktorá obsahuje rovnaké bielkovinové pásy ako gél.
Bielkoviny sa lepšie viažu na nitrocelulózu pri nižšom pH, preto treba hľadať optimálnu hodnotu pH. Tak isto musíme dávať pozor aby neboli žiadne vzduchové bubliny medzi membránou a gélom, lebo sa bielkoviny nepremiestnia.

3) Inkubujeme nitrocelulózovú membránu primárnou protilátkou. Primárna protilátka sa naviaže na našu bielkovinu a vytvorí komplex protilátka-bielkovina s bielkovinou, ktorá nás zaujíma.

4) Inkubujeme nitrocelulózovú membránu sekundárnou protilátkou. Táto protilátka by mala byť komlpex protilátka-enzým. Sekundárna protilátka by mala byť protilátka proti primárnej. To znamená, že sekundárna protilátka sa naviaže na primárnu tak ako sa primárna protilátka naviazala na bielkovinu. Enzým je tu na to, aby nám to všetko umožnil vizualizovať. Je to akokeby molekulárna svetlica zachytená na protilátkach, ktorá nám ukazuje čo sa deje.

5) Na to, aby sme videli náš enzým v činnosti, potrebujeme ho inkubovať v súbore reakcii, ktoré sú špecifické pre daný enzým. Ak sme všetko spravili správne, budeme vidieť pásy kdekoľvek je komplex bielkovina -primárna protilátka - sekundárna protilátka -enzým, alebo inými slovami tam, kde je naša hľadaná bielkovina.

6) Položíme RTG film na gél aby sme našli žiarenie, ktoré vychádza z enzýmu. Reakcia väčšinou vyprchá za hodinu.

III. Northern blotting

Úvod:
Northernov prenos nám umožňuje zistiť prítomnosť, neprítomnosť a relatívne množstvo špecifických RNA sekvencií, ktoré nás zaujímajú.

Syntetizovaním označených sond napríklad luciferázou prípadne izotopmi môžeme nepriamo zisťovať prítomnosť, alebo neprítomnosť viacerých špecifických RNA sekvencií. Mechanizmus metódy:
RNA gély sú prenesené na nitrocelulózový papier za prítomnosti roztoku NaOH, ktorý prerába ich dvojitý reťazec na jednoduchý reťazec a označené sondy a tak ďalej. Po prepláchnutí a vysušení, bude každá RNA so sekvenciou komplementárnou k sekvencií sondy naviazaná na nitrocelulózový papier. Následne sa vizualizuje po exponovaní na RTG film, alebo použitím fluorescenčných substrátov. Táto metóda je veľmi výkonný spôsob určovania, či konkrétny gén bol prepísaný na mRNA a čí tým došlo k jeho expresií v konkrétnom type tkaniva, alebo za akých podmienok je expresia regulovaná, čo zistíme jeho prítomnosťou alebo jeho relatívnym zastúpením v signále.


IV. Aplikácia

- Molekulárne portréty nádorov na prsníku(Bolo analyzovaných 8102 génov pre 65 druhov rakovinových tkanív(niektoré pred a niektoré po liečbe). Dovoľuje nám to klasifikovať typy nádorov podľa génov).

- Diagnostika Kosáčikovitej anémie. Pri K.A. sa zmení jednej zo 146 aminokyselín v β-globínovom reťazci hemoglobínu. Šiesta kyselina od začiatku je nahradená za valín. Krvinky potom nadobúdajú mesiačikovitý tvar. Rozšírená najmä v oblasti, kde sa vyskytuje malária. Ľudia sú potom voči nej odolnejší.