I. Southern blotting (Metóda polymorfizmu dĺžky restrikčných fragmentov – RFLP)

Úvod:
Southern blotting bol pomenovaný podľa Edwarda M. Southerna, ktorý vyvinul tuto metódu v Edinburghskej Univerzite v roku 1970. V tejto metóde sa molekuly DNA prenášajú z agarózového gélu na membránu. Southernov prenos je vyvinutý na nájdenie časti sekvencie DNA. Napríklad Southernov prenos môže byť použitý na nájdenie konkrétneho génu v celom genóme.
Množstvo DNA potrebnej na túto techniku závisí na veľkosti a špecifickej aktivite sondy. Mechanizmus metódy:

1) Naštiepenie DNA príslušným restrikčným enzýmom, čím získame DNA úseky zakončené rovnakými sekvenciami.

2) Nanesenie štiepenej DNA na agarózový gél.

3) Denaturácia DNA:
Celý roztok sa vloží do zásaditého roztoku(pH = 12), čím sa porušia vodíkové väzby a oddelia sa.

4) Neutralizácia:
Gél sa vloží do neutralizačného roztoku, čím sa zamedzí opätovnému spárovaniu DNA.

5) Prenos denaturovanej DNA na membránu:
Zvyčajne sa používa nitrocelulózová, nylonová alebo pozitívne nabitá nylonová membrána. Nitrocelulózová má schopnosť naviazať okolo 100μg/cm, pričom nylonová môže naviazať až 500μg/cm. Väčšinou sa používa nylonová membrána, keďže má väčšiu kapacitu a je menej krehká. Prenos prebieha pomocou kapilárnych javov, čo trvá niekoľko hodín. Tieto javy "ťahajú" roztok cez gél do membrány , ktorá zachytí rozštiepenú DNA.
Namiesto kapilárnej techniky môžeme použiť aj vákuovú. Pri tejto metóde vákuum "ťahá" SSC pufor cez membránu. Funguje podobne ako kapilárna metóda, ale viac SSC prejde cez gél a membránu, takže je rýchlejšia(trvá približne hodinu). (SSC zabezpečuje vysokú slanosť, ktorú potrebujeme na prenos DNA.)
Následne ožiarime membránu UV žiarením, čo preruší spojenia medzi DNA a membránou. Namiesto použitia UV svetla môžeme nitrocelulózovú membránu zapiecť pri teplote 80 stupňov C, pričom treba dávať pozor na vysokú horľavosť. 6) Hybridizácia:
V tomto kroku sa spája ľudská DNA a sonda(= 1 vláknový úsek, ktorého sekvenciu poznáme a zisťujeme či je alebo nie je prítomná v ľudskej DNA, prípadne koľkokrát sa tam takýto úsek nachádza).
Sondy môžu byť rádioaktívne(niektoré nukleotidy sú označené izotopom), alebo fluorescenčne(pomocou biotínu = bioxigenín) značené. Membrána, ktorá vyžaruje rádioaktivitu na určitých miestach sa dá do špeciálnej kazety s RTG filmom a nechá sa exponovať. Následne sa film vyvolá.

II.