Výzkumy sa zameriavali hlavne na lysozym a jeho mechanizmus pôsobenia nakoniec objasnil v roku 1937 Ernst Chain, židovský utečenec z nacistického Nemecka, že u vnímavejších baktérií pleseň štiepi polysacharidy v ich bunkových stenách a vyvoláva tak ich rozklad. Dôslednejší výskum antibakteriálnych látok začal až v roku 1938. medzi zkúmanimi organizmami bol aj kmeň Penicillium notatum, ktorý bol uchovávaný Flemingovov skupinou od roku 1929. Biochemik Chain a chemik E.P.Abraham zopakovali radu prácvedúcich k izolácii a purifikáciu penicillínu


25 mája 1940 bol u ôsmich myší infikovaných smrteľnou dávkou streptokokov spravený pokus in vivo. Trom myšiam bolo podaných niekoľko dávok penicilínu, jedna myš dostala jednu dávku a zbytok žiadny penicilín. Prvé tri myši prežili, ostatné zahynuli. Ďalšie výskumy tieto výsledky potvrdili a tak sa po prvý krát ukázal obrovský antibakteriálny potenciál penicilínu.
Prvý pacient bol tridsaťtri ročný policajt Albert Alexander, ktorý po škrabnutí o ružový ker dostal infekciu baktériami Staphilococcus aureus a Streptococcus pyonges. Do začiatku liečby prišiel o oko a na tvári a na ruke mal niekoľko abscesov a poškodené pľúca. 12. 2. dostal dvesto miligramov penicilínu a následne päť dní po tom ďalšie injekcie 100mg v dvoch - štyroch hodinových intervaloch. Jeho stav sa výrazne zlepšil, 17.2. už mal teplotu normálnu, mal chuť do jedla a infekcia zjavne ustupovala. Zásoby penicilínu však boli veľmi obmedzené, lekári sa dokonca snažili získať penicilín, ktorý pacient vylúčil močom. Liečba musela byť zastavená, aby sa mohol penicilín podať inému ťažko chorému pacientovi. Keď však lekári pre ďalšieho pacienta spotrebovali všetky zásoby, došlo u Alexandra po 10. dňoch k recidíve. 15.2. zomrel na stafylococovú septikémiu. Liečba ďalšieho pacienta, 15 ročného chlapca, ktorý dostal streptokokovú septikémiu po operácii bedrového kĺbu, však smrťou neskončila. Za 5 dní dostal celkovo 3,4 g penicilínu a úplne sa zotavil. V priebehu roku 1942 liečila oxfordská skupina 187 pacientov, z nich iba hŕstka na liečbu nereagovala. Do projektu sa zapojil dokonca aj Fleming, keď jeho rodinný priateľ, H. Lambert, dostal zápal mozgových blán. Penicilín získal Florey a Fleming ho v injekciách podával najprv do žily, keď však zistil, že látka do mozgu nepreniká, začal ju podávať aj priamo do priestoru v mozgu. Napriek tomu, že týmto spôsobom sa liek doteraz nepoužíval, pacient sa rýchlo zotavil a to Fleminga nakoniec presvedčilo o význame tohto nového antibiotika. Florey klinickými skúškami penicilínu, zvlášť pri liečbe vojnových zranení, zistil, že penicilínom sa dá do 12 hodín po aplikácii úplne vyliečiť kvapavka.