Penicilín

Od roku 1670, kedy Antonyvan Leeuwenhoek vynašiel mikroskop, bolo možné sa na mikroorganizmy alebo "animalkuly" pozerať. Pokrok v mikrobiológii nemohol napredovať preto, že predstava o tom, že mikroorganizmy sa množia inak ako zásahom zhora, bola pokladaná za kacírstvo. Celé storočia panovala predstava, že pliesne sa na rozkladajúcej sa hmote objavovali spontánne. Tieto predstavy poprel nakoniec v 18. storočí Spallanzami, ktorý pokusmi dokázal, že uvarené a dobre uskladnené mäso zostane úplne bez kontaminovania. Pevný základ mikrobiológie však postavil svojimi elegantnými pokusmi Pasteur, vďaka nemu bola formulovaná teória choroboplodných zárodkov. Pasteur vyštudoval chémiu a na počiatku svojej vedeckej dráhy sa venoval procesu kvasenia (fermentácia). Preukázal, že niektoré mikroorganizmy (kvasinky) umožňujú kvasenie alkoholu, zatiaľ čo iné (laktobacily) pôsobia na fermentácii mliečnych produktov. V týchto štúdiách Pasteur dokázal všadeprítomnosť rady organizmov a predovšetkým ich hojný výskyt v pôde. Ako prvý preukázal prenos nákazlivých chorôb John Snow v roku 1854, keď našiel zdroj izolovanej epidémie cholery
v kontaminovanej studni v Londýne. V roku 1865, keď Lister začal používať kyselinu karbolovú (fenol) ako antiseptický prostriedok, pohybovala sa úmrtnosť po amputáciách okolo 50% a na bojisku sa blížila k 100%. Prírodné fenoly sa používali celé storočia ako konzervačné latky, napr. Egypťania z nich pripravovali balzamovacie zmesi, ale väčšina zdravotníkov si nedokázala pripustiť, že kontaminácie rán boli spôsobované vzduchom, alebo aj lekárom prenášané patogény. Lister vyskúšal kyselinu karbonilovú, pretože sa už pred tým osvedčila v čistení kanálov. Ďalšie fenoly, ako kyselina salicylová a guajakol, sa požívali tak zvnútra ako zvonka. Myšlienku že mikroorganizmy sa vzájomne zabíjajú, priviedol na svet Pasteur roku 1877. Preukázal, že množenie anthraxových bacilov v moči sa dá zabrániť niekoľkými bežnými baktériami. Za 1. svetovej vojny pracoval Alexander Fleming ako bakteriológ. Zaoberal sa zvlášť úrazmi spojenými so zložitými fraktúrami, u ktorých bolo veľké riziko plynnatých gangrén. Po návrate do Anglicka prijal Fleming miesto v nemocnici St. Marys Hospital v Paddingtone. Fleming pred odchodom na dovolenku nechal celú hromadu misiek s kultúrami stafylokokov na kraji stola. Za jeho neprítomnosti sa oknom do laboratória dostal jeden relatívne vzácny kmeň Penicillia a misky kontaminoval.

Spočiatku bolo chladno, a tak sa penicilínová pleseň rozrastala, neskoršie sa oteplilo a zase sa darilo baktériám. Keď sa Fleming vrátil a naskladal misky do podnosu s dezinfekciou si všimol miesta s plesňou a okolo nej neprítomnosť baktérií. Na svojich kolegov Fleming veľký dojem neurobil. Pleseň však rozmnožil a za nejakú dobu preukázal, že výťažky z plesne inhibujú rast streptokokov, stafylokokov, pneumokokov, meningokov, gonokov, bacilov záškrtu. Penicillium malo vtedy oveľa väčšie spektrum pôsobenia než lysozym a dalo sa zrovnať s najsilnejšími antiseptickými prostriedkami. Akonáhle bola jeho totožnosť overená, nazval Fleming extrakt, ktorému sa hovorilo plesňová šťava, penicilínom. Fleming nariadil svojim dvom vysokoškolsky vzdelaným asistentom, F. Rydleymu a S.Craddockovi, aby vypestovali pleseň vo väčšom množstve, ktoré by sa dalo biologicky skúmať. Takto získaný penicilín mal vysokú antibakteriálnu pôsobnosť, stabilizovať sa však dal iba na 2-3 týždne pri neutrálnom pH. Pokusy prevádzané in vivo ukázali, že biologická životnosť penicilínu je veľmi krátka a to isté platí o jeho stabilite. To znížilo uplatnenie látky v praxi, avšak Fleming napriek tomu prípravok skúšal na niekoľkých ľudských pokusných králikoch. Až neskôr po dlhšej dobe zaznamenal Fleming úspech a to u jedného zo svojich laborantov, ktorý sa mal účastniť významného závodu v streľbe. Dostal však zápal spojiviek. Aplikácia penicilínu na oči zápal úplne vyliečila a svet by sa mohol stať svedkom veľkej antibiotikovej revolúcie, len keby Fleming vedel rozprávať na verejnosti. Jeho prednáška nevzbudila takmer žiadny záujem, publikum z nej nepochopilo význam objavu. Možno aj preto že pôsobenie plesní Penicillium popísala už rada autorov pred ním, ale jeho objav bol výnimočný tým že našiel veľmi silný kmeň. Trvalo ešte 12 rokov, než vyšiel potenciál penicilínu najavo. Skupina v nemocnici St. Marys pleseň v nasledujúcich desaťročiach rozmnožovali a používali ju predovšetkým k likvidovaniu baktérii, ktoré bránili v rastu laboratórnych vzoriek
Howard Florey, pôvodom Austrálčan, vyštudoval lekársku fakultu v Adelaide, potom dostal štipendium k študovaniu na Oxforde. Zaujímal sa o vlastnosti lysozymu v slinách, slzách a ďalších sekrétoch kozy, zajaca a potkana tak trochu v stopách Fleminga. V roku 1935 sa Florey stal predsedom Patologickej sekcii na fakulte sira Williama Dunna v Oxforde a začal okolo seba sústreďovať skupinu mladých inteligentných vedcov.

Výzkumy sa zameriavali hlavne na lysozym a jeho mechanizmus pôsobenia nakoniec objasnil v roku 1937 Ernst Chain, židovský utečenec z nacistického Nemecka, že u vnímavejších baktérií pleseň štiepi polysacharidy v ich bunkových stenách a vyvoláva tak ich rozklad. Dôslednejší výskum antibakteriálnych látok začal až v roku 1938. medzi zkúmanimi organizmami bol aj kmeň Penicillium notatum, ktorý bol uchovávaný Flemingovov skupinou od roku 1929. Biochemik Chain a chemik E.P.Abraham zopakovali radu prácvedúcich k izolácii a purifikáciu penicillínu


25 mája 1940 bol u ôsmich myší infikovaných smrteľnou dávkou streptokokov spravený pokus in vivo. Trom myšiam bolo podaných niekoľko dávok penicilínu, jedna myš dostala jednu dávku a zbytok žiadny penicilín. Prvé tri myši prežili, ostatné zahynuli. Ďalšie výskumy tieto výsledky potvrdili a tak sa po prvý krát ukázal obrovský antibakteriálny potenciál penicilínu.
Prvý pacient bol tridsaťtri ročný policajt Albert Alexander, ktorý po škrabnutí o ružový ker dostal infekciu baktériami Staphilococcus aureus a Streptococcus pyonges. Do začiatku liečby prišiel o oko a na tvári a na ruke mal niekoľko abscesov a poškodené pľúca. 12. 2. dostal dvesto miligramov penicilínu a následne päť dní po tom ďalšie injekcie 100mg v dvoch - štyroch hodinových intervaloch. Jeho stav sa výrazne zlepšil, 17.2. už mal teplotu normálnu, mal chuť do jedla a infekcia zjavne ustupovala. Zásoby penicilínu však boli veľmi obmedzené, lekári sa dokonca snažili získať penicilín, ktorý pacient vylúčil močom. Liečba musela byť zastavená, aby sa mohol penicilín podať inému ťažko chorému pacientovi. Keď však lekári pre ďalšieho pacienta spotrebovali všetky zásoby, došlo u Alexandra po 10. dňoch k recidíve. 15.2. zomrel na stafylococovú septikémiu. Liečba ďalšieho pacienta, 15 ročného chlapca, ktorý dostal streptokokovú septikémiu po operácii bedrového kĺbu, však smrťou neskončila. Za 5 dní dostal celkovo 3,4 g penicilínu a úplne sa zotavil. V priebehu roku 1942 liečila oxfordská skupina 187 pacientov, z nich iba hŕstka na liečbu nereagovala. Do projektu sa zapojil dokonca aj Fleming, keď jeho rodinný priateľ, H. Lambert, dostal zápal mozgových blán. Penicilín získal Florey a Fleming ho v injekciách podával najprv do žily, keď však zistil, že látka do mozgu nepreniká, začal ju podávať aj priamo do priestoru v mozgu. Napriek tomu, že týmto spôsobom sa liek doteraz nepoužíval, pacient sa rýchlo zotavil a to Fleminga nakoniec presvedčilo o význame tohto nového antibiotika. Florey klinickými skúškami penicilínu, zvlášť pri liečbe vojnových zranení, zistil, že penicilínom sa dá do 12 hodín po aplikácii úplne vyliečiť kvapavka.

To malo značný význam, pretože v tej dobe mala severná Afrika viac ľudí postihnutých pohlavnými chorobami, než obetí vojny. Nobelova cena za fyziológiu a medicínu bola v roku 1945 udelená spoločne Flemingovi, Floreymu a Chainovi. Keď vojna skončila, podarilo sa Dorothy Hodgkinovej za použitia röntgenovej kryštalografie objasniť štruktúru najvýznamnejšieho typu penicilínu - Penicillium chrysogenum - tzv. penicilín G. Vedci sa taktiež pokúšali vytvoriť syntetický penicilín. Praktickú cestu k vytvoreniu 6 - aminopenicilínovej (hlavného stavebného kameňa penicilínu) objavil John Sheehan z Masachusettského technologického inštitútu. Vďaka tomu bolo možné vytvárať nové semisyntetické penicilíny. Okrem toho firma Beechams zistila, že kyselina 6-aminopenicilínová je vlastne stály produkt prítomný v kvasnej zmesi a že ju možno izolovať a premeniť v nové typy penicilínu. Firma Eli Lilly v USA medzičasom objavila, že pridaním prekurzorov postranného reťazca do kvasného roztoku podporovalo produkciu odpovedajúcich typov penicilínu. Vďaka tomu sa v polovici 50.rokov podarilo zaviesť v kyselinách relatívne stabilný V-penicilín (fenoxymetylpenicilín). Ten sa dal podávať nielen injekciou a tak mohli penicilín predpisovať i praktickí lekári. Antibiotiká boli vtedy ľahko dostupné a tak ich praktickí lekári predpisovali možno až príliš často, navyše sa tieto látky vo veľkom pridávali do krvných zmesí pre zvieratá. Baktérie si teda museli vytvoriť nejaký ochranný systém, inak by vyhynuli. Keďže sa tieto baktérie rozmnožujú asi každých 20 minút, rezistentné kmene sa vyvinuli rýchlejšie než u iných organizmov. Do začiatku 60. rokov si väčšina bakteriálnych kmeňov vytvorila istý stupeň rezistencie voči penicilínu, vyvinuli si totiž špeciálne enzýmy betalaktamázy, ktoré rozštiepia časť penicilínovej štruktúry a penicilín tak prestáva pôsobiť. Baktérie citlivé na penicilín, takzvané grampozitívne druhy, majú v bunkovej stene polysacharidové reťazce, ktoré sú spojené s reťazcami polypeptidovými a nakoniec priečne prepojené do trojrozmernej mriežky. Keď sa bakteriálna bunka rozdelí, musí si vytvoriť nový materiál na bunkovú stenu. Vytvára ho tak, že premení dvojrozmernú štruktúru polysacharid - polypeptid do trojrozmernej priečne pospájanej štruktúry bunečnej steny. V podstate ide o odštepenie terminálnej aminokyseliny (alanínu) z jedného polypeptidového reťazca a pripojenia predposlednej aminokyseliny na aminokyselinu poslednej v polypeptidovom postrannom reťazci. Penicilín funguje tak, že inhibuje enzým, ktorý sa tohto procesu účastní.

Tento enzým sa nechá zmiasť tvarovou podobnosťou antibiotika a posledných dvoch aminokyselín (alanín - alanín) v polypeptidovom reťazci a reaguje s antibiotikom. Neoddeliteľne sa k nemu pripojí a nemôže teda vstúpiť do priečneho prepojenia mriežky. U rezistentných baktérií napadnú betalaktamázy štvorčlenný prstenec penicilínu a rozlomia ho a tým mu zabránia reagovať s transpeptidázou. Konštrukcia bunečnej steny baktérií môže teda ďalej bez zábran pokračovať. Okrem rezistencií sa však pri klinickej aplikácii penicilínu vyskytujú i ďalšie obtiaže. Za prvé malá časť populácie je na tieto lieky alergická, za druhé väčšina penicilínu nepôsobí proti gramnegatívnym baktériám, ako je napr. salmonela alebo seudomonas. Tieto organizmy sú zvlášť rozšírené v rozvojových zemiach, kde spôsobujú vysiľujúce infekcie a predstavujú veľké nebezpečenstvo pre pacientov s oslabeným imunitným systémom. Ide o ľudí s rakovinou a v poslednej dobe taktiež pacienti s AIDS. Brotzu bol riaditeľom inštitútu v Cagliari na Sardínii a z vodovodných trubiek sa mu podarilo izolovať pleseň, ktorá zastavovala rast bacilov týfusu. Toto malo veľký význam, pretože penicilín na tieto gramnegatívne organizmy nepôsobil. Úspešne liečil pacientov s abscesom, s vredmi, s týfusom a paratýfusom. Talianske úrady o jeho prácu nemali záujem a Brotzu sa teda nakontaktoval na Floreyho a poslal mu vzorku kultúry tejto plesne. Pleseň bola identifikovaná ako Cephalosporium acremonium a škola Wiliama Dunna sa okamžite ujala skúmať ich antibakteriálne účinky. Týmu, ktorý viedol E.P.Abrahám, sa podarilo izolovať slabé antibiotikum a to bolo pomenované cefalosporin C. Oproti G-penicilínu malo dve výhody - nízku toxicitu a rezistenciu voči b-laktamázam.