V druhej polovici 16. storočia prenikol z nemeckých krajín do Uhorska protestantizmus. V Bratislave, ktorá bola mestom s prevažne nemeckým obyvateľstvom, sa myšlienky reformácie rozšírili veľmi rýchlo. Po vydaní privilégia kráľa Maximiliána II. v roku 1564, ktorým povolil prijímanie pod obojím, prešla väčšina bratislavských mešťanov na evanjelickú vieru.

V 17. storočí prežívala Bratislava jedno z najťažších období svojej histórie. Za stavovských povstaní uhorskej šľachty proti Habsburgovcom ju viac ráz obsadili a vydrancovali vojská bojujúcich strán, poškodili ju viaceré požiare a iné živelné pohromy, niekoľkokrát zasiahla mesto morová epidémia.

Rekatolizácia, ktorá sa začala v roku 1600 za vlády Rudolfa II., vyvolala v celej krajine voči Habsburgovcom prudký odpor. Preto je 17. storočie v Uhorsku a teda aj v Bratislave poznačené neutíchajúcimi protihabsburskými povstaniami, pričom naďalej pokračovali aj vojny s Turkami.

Z protihabsburských povstaní Bratislavu najviac zasiahlo povstanie sedmohradského kniežaťa Gabriela Betlena. Betlen v rokoch 1619-1621 držal mesto vo svojej moci a jeho povstanie bolo definitívne ukončené roku 1626 mierom podpísaným v Bratislave. Napriek odporu viedenského dvora presadili bratislavskí evanjelici stavbu dvoch evanjelických kostolov - nemeckého (1636-1638) a slovensko-maďarského (1640). Ďalšie stavovské povstania a zostrenie rekatolizácie opäť nepriaznivo vplývali na rozvoj Bratislavy. Evanjelici museli odovzdať obidva svoje kostoly - nemecký jezuitom, slovensko-maďarský uršulínkam. Až po porážke Turkov roku 1683 pri Viedni nastalo mierne uvoľnenie rekatolizačného tlaku a evanjelici si mohli postaviť dva nové kostoly a vlastnú evanjelickú strednú školu - lýceum.

V 18. storočí sa Bratislava stala nielen najväčším a najvýznamnejším mestom Slovenska, ale i celého Uhorska. V tomto storočí sa postavilo veľa honosných palácov uhorskej aristokracie, stavali sa kostoly, kláštory a iné cirkevné budovy, prestaval s rozšíril sa hrad, vyrástli celé nové ulice a počet obyvateľov sa strojnásobil. Konali sa tu zasadania stavovského snemu, korunovácie kráľov a kráľovien, pulzoval tu čulý kultúrny a spoločenský život.

Obdobie najväčšieho rozvoja mesta predstavuje doba vlády Márie Terézie (1740-1780). Od jej nástupu začala usmerňovať stavebný vývoj v meste stavebná kancelária Uhorskej kráľovskej komory, ktorá riadila najmä stavbu erárnych budov (palác Uhorskej kráľovskej komory, Vodná kasáreň, a i.). Veľké stavebné úpravy sa vykonali aj na hrade, ktorý sa stal reprezentačným kráľovským sídlom (resp. jeho uhorského miestodržiteľa) a strediskom spoločenského a politického života na najvyššej úrovni.

V roku 1775 nariadila Mária Terézia zbúrať mestské hradby a brány a zasypať širokú vodnú priekopu, ktorá obkolesovala mesto. Vznikol tak priestor pre ďalšiu výstavbu palácov a na mieste vodnej priekopy medzi Vydrickou a Rybárskou bránou vznikla promenáda, na konci ktorej pred Rybárskou bránou bolo v roku 1776 postavené Mestské divadlo. Novotou v architektonickom rozvoji mesta bola aj stavba letných palácov s okrasnými záhradami na okraji mesta.

Vláda Jozefa II. znamenala pre Bratislavu ústup zo slávy. Bratislava prestala byť hlavným mestom Uhorska. Na Jozefov príkaz sa roku 1783 odsťahovala do Budína Miestodržiteľská rada a iné centrálne úrady a 13. mája odviezli do Viedne aj kráľovskú korunu stráženú dovtedy na Bratislavskom hrade. Odsťahovanie ústredných úradov vyvolalo priam masový odchod šľachty z mesta. Bratislava sa z hlavého mesta krajiny razom premenila na provinčné mesto.

Bratislavu zasiahli aj Jozefove reformy. Zrušených bolo aj niekoľko cirkevných rádov sídliacich v meste. Majetky rádov boli rozpredané a budovy kláštorov premenené na školy a nemocnice. Jozef zriadil v Bratislave Generálny seminár pre výchovu kňazského dorastu, ktorý bol umiestnený na Bratislavskom hrade prestavanom na tento účel. Tu študoval aj Anton Bernolák a mnohí ďalší významní osvietenskí vzdelanci.