V prvej polovici 16. storočia nastali v Uhorsku vážne zmeny, ktoré značne ovplyvnili jeho ďalší vývin. V prvom rade možno uviesť vplyv tureckej invázie. Turci sa dostali až na južné Slovensko. Ďalej to bola porážka uhorských vojsk pri Moháči v roku 1526, v ktorej padol aj uhorský kráľ Ľudovít II., ktorý nezanechal následníka trónu. Okrem neho padlo aj veľa iných významných osobností (5 vyšších duchovných), čo vnieslo dezorganizáciu do života v Uhorsku.

V treťom rade to bol nástup Habsburgovcov na uhorský trón, ktorý vytvoril nesúhlas a odpor veľkej časti uhorskej šľachty, ktorá zorganizovala odboj proti tomuto právnemu aktu a stavu. V štvrtom rade to boli myšlienkové prúdy, ktoré sa šírili zo zahraničia v podobe anabaptizmu, protestantismu a rôznych filozofických koncepcií, ktoré spochybňovali katolícky univerzalizmus. Dediny, v ktorých obyvateľstvo nebolo plnoprávne boli v právomoci zemepánov a oni rozhodovali o ich viere.

Uhorská šľachta sa rozdelila na dva nepriateľské tábory. Jedni pozvali na kráľovský trón Habsburgovcov z Rakúska a druhí prehlásili za svojho kráľa vojvodu Jána Zápoľského. Krajina sa zmietala vo vnútorných bojoch, z čoho najviac ťažili Turci, ktorí v roku 1541 dobyli Budín. Uhorsko sa v týchto okolnostiach rozdelilo na tri časti:

1. Západné Uhorsko pripadlo Habsburgovcom
2. Stredná časť krajiny patrila Turkom
3. Z východnej časti sa vytvorilo „Sedmohradské kniežatstvo", ktoré vyhlásilo Jána Žigmunda, syna Jána Zápoľského za Sedmohradské knieža. Tieto kniežatá si robili nárok na kráľovský trón a často organizovali povstania proti Habsburgovcom. Územie Zakarpatska tvorilo koridor medzi týmito súperiacimi stranami až do roku 1711, keď Habsburgovci zvíťazili definitívne nad sedmohradskými kniežatami.

Osobitnú ťažkosť pre riadny cirkevný život predstavovala skutočnosť, že svetskí feudáli si nárokovali právo zasahovať do cirkevných vecí, schvaľovať biskupov a obmedzovať ich činnosť. Mukačevský kláštor a väčšina územia obývaného príslušníkmi východného obradu patrili pod správu sedmohradských kniežat. Protestanti obsadili mukačevský kláštor, ktorý bol zároveň aj rezidenciou biskupa. Zhabali cirkevné majetky a miešali sa do najvnútornejších vecí cirkevného života. Osud mukačevského biskupa bol tak v rukách mukačevského pána.

Keď títo zemepáni prešli na protestantizmus, snažili sa v tomto smere ovplyvňovať aj svojich poddaných. Títo boli však veľmi naviazaní na svoju východnú liturgiu a obrady, a preto pokusy protestantských kazateľov neboli príliš úspešné.

Aj zo strany katolíckej cirkvi boli viaceré pokusy na činnosť medzi týmito veriacimi, ale aj tu bolo podvedomé stotožňovanie katolicizmu s príslušnosťou k latinskému obradu, skôr brzdou skutočnej úspešnosti.

Mukačevský kláštor sv. Mikuláša na Černečej Hore pri Mukačeve je počas vojnových zápolení neraz vydrancovaný. Sedmohradské kniežatá sa veľa ráz pomstili mukačevským biskupom za to, že sa postavili na stranu Habsburgovcov. Zničili fundančné listiny a dokumenty o rozličných privilégiach. Tak napr. biskup Bazil II. preto osobne vyhľadal v Prahe cisára Maximiliána a informoval ho o neutešenej situácii. Mukačevskí biskupi postupne prišli o všetky výsady a privilégia a preto, že nenašli ochranu ani u cisára, začínajú hľadať v Ríme.

Samotní uhorskí panovníci sa snažili rôznymi obmedzeniami priviesť Ruthénov k únii, teda zjednoteniu s Rímom. Treba mať na zreteli, že toto územie predstavovalo akúsi deliacu čiaru medzi východom a západom, čo sa prejavovalo aj kultúrne, mocensky a nábožensky, pričom proces zjednocovania bol vlastne len oficiálnym potvrdením nikdy neprerušenej orientácie na Rím.

V polovici 16. storočia v Uhorsku začína proces rekatolizácie. Dôležitú úlohu v ňom zohrali ostrihomskí arcibiskupi, vo veľkej miere aj rehoľné a svetské duchovenstvo. Základy katolíckej obnovy v uhorskom kráľovstve položil ostrihomský arcibiskup Mikuláš Oláh (1553-1568), ďalej v rekatolizačnom diele pokračoval ďalší ostrihomský arcibiskup František Forgách (+1615). Význačnú úlohu v rekatolizácii v ďalšom období zohral arcibiskup Peter Pázmány.

Jeho zásluhou sa vrátili mnohé rodiny v Uhorsku späť ku katolíckej cirkvi. Protestanti tak stratili veľkú časť šľachty. Mukačevské panstvo bolo od roku 1588 v rukách protestanských zemepánov, čo malo neblahé následky pre cirkevný život mukačevského biskupstva. Protestanti sa všemožne usilovali dostať pod svoj vplyv aj jednoduchý ľud. Uhorská šľachta čoskoro vybadala zámery protestantov. Za pomoci rímskokatolíckych misionárov-rehoľníkov pokúsila sa o latinizáciu Zakarpatska. Snahy protestantov i katolíkov boli márne.

Za danej situácie sa ukázalo jediné riešenie a to Únia. Zjednocovaciemu procesu veľmi napomohli Drugethovci, najmä syn Juraj Drugeth III., ktorý sa vrátil do katolíckej cirkvi. Od roku 1605 bol pánom humenského panstva. Úprimne si prial zjednotenie na svojom panstve a aj preto si zavolal z Poľska přzemyšlského gréckokatolíckeho biskupa Atanáza Krupeckého (1610-1652), ktorý v septembri roku 1613 naozaj prišiel do Humenného. S ním prišli aj dvaja jezuiti.

Tento posledný fakt je tiež veľmi dôležitý pre pochopenie neskoršej nedôvery zo strany niektorých „neprajníkov" Únie, ktorí si mysleli, že prehlásenie Únie znamená otvorené hlásenie zrieknutia sa starodávnej byzantskej cyrilometodskej tradície a obradu a jej zámenu za latinskú.

Slávnostné verejné prehlásenie zjednotenia sa malo uskutočniť na sviatok Zoslania svätého Ducha roku 1614 na pútnickom mieste Krásny Brod, kde mal byť v ten istý deň posvätený aj nový chrám. Bolo to však prenáhlené rozhodnutie. Hoci duchovenstvo vo veľkej miere bolo na to pripravené, ale prostý ľud nebol pripravený na tento krok a tak niekoľkí neprajníci skutočne pobúrili ľud a celá akcia sa skončila neúspechom.

Prvým biskupom mukačevským, ktorý chcel zjednotenie bol Bazil Tarasovič (1634-1646). Cieľavedome pripravoval úniu s Rímom. Dostal sa však do veľkej nemilosti u svojho zemepána Juraja Rákoczyho, ktorý ako kalvín robil všemožné prekážky proti zjednoteniu. Došlo to až tak ďaleko, že biskupa vzali od oltára počas slúženia svätej liturgie a uväznili ho. S pomocou kráľa Ferdinanda III. sa dostal na slobodu, ale pre ďalšie násilenstva sa najprv vzdal biskupstva a odišiel do mesta Nagykálló. Začiatkom mája 1642 zložil vo Viedni pred cisárom a apoštolským nunciom katolícke vyznanie viery. Na to dostal možnosť spravovať západnú časť svojej eparchie, kde aj naďalej šíril myšlienku únie medzi veriacimi a duchovenstvom.

Avšak Tarasovič, aby sa mohol vrátiť do Mukačeva, bol nútený oficiálne sa zriecť zjednotenia. Jeho presvedčenie pramenilo z nebezpečenstva kalvinizmu medzi nezjednotenými. Vnútorne však zostával naklonený zjednoteniu, čo potvrdil aj doporučením svojho nástupcu v osobe Petra Parthéna Petroviča za biskupa.

Spomínaný Petrovič a bazilián Kosovický chodili z dediny na dedinu a všade šírili myšlienku únie. S priaznivými myšlienkami svojej apoštolskej práce za zjednotenie išli do mesta Eger (Jáger) ku katolíckemu biskupovi Georgiovi Jakušičovi ohlásiť snahu zjednotenia s katolíckou cirkvou a dojednať formálny vznik únie.

Únia bola nakoniec uzavretá 24.4.1646 v hradnej kaplnke Drugethovcov v Užhorode za prítomnosti jágerského biskupa Jakušiča, grófky Anny Jakušičovej, (manželky nebohého Jána Drugetha), baziliánov Petra Parthéna Petroviča a Gabriela Kosovického, ako aj prítomných 63 kňazov východného obradu. Slávnostné vyhlásenie zjednotených kňazov v Užhorode prešlo do dejín ako „Užhorodská únia". Akt Užhorodskej únie bol potvrdený 14. mája 1648 ostrihomským arcibiskupom a prímasom Uhorska Jurajom Lippayom, ktorý až následne v roku 1651, informoval o tom Svätú Apoštolskú Stolicu v Ríme.

V priebehu nasledujúcich 15 rokov sa k únii pridali prakticky všetci kňazi. V roku 1650 ich bolo už takmer 100, v roku 1652 - 200, roku 1654 - 400, a v roku 1661 - vyše 500. Únia bola postupne prijatá v Užskej, Zemplínskej, Šarišskej, Abovskej, Turnianskej aj Gemerskej župe, ba neskôr v roku 1733 aj v Berehovskej, Ugočskej a Marmarošskej župe. Na území Mukačevskej eparchie v roku 1759 už prakticky nebolo oficiálne nezjednotených veriacich.

V roku 1651 bola vyslovená požiadavka zriadiť samostatné gréckokatolícke biskupstvo. K žiadosti sa pripojili aj gréckokatolíci stolíc Spišskej, Turňanskej a Gemerskej, ktorí dovtedy patrili k spišskému prepošstvu.

Zjednotený biskup Parthénius prijal v roku 1651 biskupskú vysviacku v Belehrade (Sedmohradsku) z rúk pravoslávneho arcibiskupa Štefana Simonoviča. Mnísi na Černečej Hore nadšene privítali nového mukačevského biskupa. Avšak kňažná Zuzanna Lorántffy, vdova po Jurajovi I. Rákoczim, zamietla Parthénia a sama vymenovala za mukačevského biskupa Jaonnicia Zejkana. Nepomohli ani zákroky cisára Ferdinanda III. Biskup Parthénius sa musel vrátiť do Užhorodu. Ostrihomský arcibiskup Juraj Lippay žiadal pre Parthénia potvrdenie na mukačevský biskupský stolec z Ríma (už 10. septembra 1651), ale toto potvrdenie vydal dňa 8. júna 1655 až nástupca Inocenta X. (1644-1655) pápež Alexander VII. (1655-1667). Mukačevská eparchia až do roku 1664 zostala rozdelená na dve časti.

Situácia sa trocha mení v roku 1660, keď zomiera kňažná Anna Lorántffy. Správkyňou Rákocziovských majetkov sa stala mladá vdova po Jurajovi II. kňažná Žofia. Pochádzala z katolíckeho šľachtického rodu Báthoryovcov. Žofia Báthory síce odstránila z mukačevského biskupského stolca pravoslávneho biskupa Zejkana, ale nechcela pripustiť ani Rímom potvrdeného mukačevského biskupa Parthénia, lebo sama chcela mať menovacie právo.